Potencial antimicrobiano y crecimiento de células osteoblásticas en superficies de titanio modificadas electroquímicamente con nanotubos e incorporación de selenio o plata. | Grupo de ánodos de titanio ICCP de Baoding

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 8298 (2022) Citar este artículo

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Las superficies de nanotubos de titanio que contienen plata, zinc y cobre han mostrado efectos antimicrobianos sin disminuir el crecimiento de células osteoblásticas. En este estudio in vitro presentamos los primeros resultados sobre la evaluación biológica de modificaciones superficiales mediante la incorporación de compuestos de selenio y plata en nanotubos de dióxido de titanio (TiO2) mediante deposición electroquímica. Se cultivaron nanotubos de TiO2 (TNT) y TNT dopado con fosfato (pTNT) en la superficie de discos de Ti6Al4V mediante anodización. Los compuestos de hidroxiapatita (HA), selenio (Se) y plata (Ag) se incorporaron mediante deposición electroquímica. Las unidades formadoras de colonias de Staphylococcus epidermidis (DSM 3269) disminuyeron significativamente en SepTNT (0,97 ± 0,18 × 106 UFC/mL), SepTNT-HA (1,2 ± 0,39 × 106 UFC/mL), AgpTNT (1,36 ± 0,42 × 106 UFC/mL). ) y Ag2SepTNT (0,999 ± 0,12 × 106 UFC/mL) en comparación con el control no modificado (2,2 ± 0,21 × 106 UFC/mL). La adhesión bacteriana se calculó midiendo el área cubierta después de la tinción fluorescente. La adherencia fue menor en SepTNT (37,93 ± 12%; P = 0,004), pTNT (47,3 ± 6,3%, P = 0,04), AgpTNT (24,9 ± 1,8%; P < 0,001) y Ag2SepTNT (14,9 ± 4,9%; P < 0,001). ) en comparación con el control no modificado (73,7 ± 11%). La formación de biopelículas y el crecimiento de células osteoblásticas (MG-63) se observaron mediante tinción con cristal violeta. La formación de biopelículas se redujo en los discos SepTNT (22 ± 3%, P = 0,02) y Ag2SepTNT (23 ± 11%, P = 0,02) en comparación con el control no modificado (54 ± 8%). En comparación con el control no modificado, las superficies SepTNT-HA y pTNT modificadas mostraron un área cubierta significativamente mayor con células osteoblásticas MG-63. Las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) confirmaron los hallazgos relacionados con el crecimiento de células bacterianas y osteoblásticas. Estos hallazgos muestran un posible efecto sinérgico al combinar selenio y plata con nanotubos de titanio.

La infección de la articulación periprotésica (PJI) sigue siendo una de las complicaciones más desafiantes después de la artroplastia total de la articulación (ATT), con un impacto dramático en la morbilidad y mortalidad de los pacientes, así como una carga socioeconómica para el sistema de salud pública1,2,3 ,4,5,6.

Debido al aumento continuo de la resistencia a los antibióticos, se han realizado muchos esfuerzos para encontrar nuevos enfoques terapéuticos antimicrobianos7. La formación de nanotubos de dióxido de titanio (TiO2) (TNT) ya ha llamado la atención debido a su potencial antibacteriano y osteointegrador en superficies de importancia ortopédica8,9,10. Se ha propuesto que el TNT reduzca las bacterias en las superficies de titanio al inhibir la adhesión bacteriana. Esto se puede conseguir mediante una mayor hidrofilicidad y una aglomeración deficiente de las células bacterianas debido a la estructura tubular del TNT11. Otra opción es aplicar un recubrimiento con propiedades bactericidas en la superficie del implante. Se ha investigado el uso de iones que matan bacterias como la plata12,13,14,15,16, el zinc17 o el selenio18,19,20,21,22 y los implantes recubiertos de plata ya están disponibles comercialmente. Además, a diferencia del mecanismo antibacteriano del TNT, estos metales matan las células bacterianas mediante la liberación de iones10. Este efecto puede incrementarse mediante el uso de nanopartículas de estos metales10. Además, se ha demostrado que el uso de TNT mejora el potencial osteogénico23, lo que también podría observarse para el selenio21,24. Sin embargo, existe cierta evidencia de que los compuestos de plata podrían influir negativamente en la osteogénesis debido a efectos citotóxicos25. Por lo tanto, incluso si algunos estudios retrospectivos pudieran mostrar una disminución de la IAP en pacientes de alto riesgo, por el momento no hay evidencia suficiente para respaldar el uso global de iones de plata en pacientes con artroplastia regular26. Un estudio de Holinka et al.27 reveló una disminución del crecimiento de células bacterianas y de la formación de biopelículas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) cuando se utiliza selenio. Sin embargo, el uso de mecanismos de dopaje/remojo para incorporar selenio en la superficie nanoestructurada hace que la deposición de selenio sea menos controlable. La hidroxiapatita (HA) es uno de los aditivos más utilizados en implantes no cementados. El mineral inorgánico que consiste en un compuesto de hidróxido de fosfato de calcio representa el estándar de oro para los agentes osteoinductores.

Con el uso de anodización, nuestro grupo de estudio pudo desarrollar una estrategia para formar TNT de forma uniforme. Además, la deposición electroquímica permitió la incorporación de partículas (metales puros o compuestos de los mismos) y otros agentes beneficiosos (por ejemplo, HA) dentro de los nanotubos para eventualmente mejorar el potencial antimicrobiano y osteointegrador28,29. Además, pudimos crear TNT con un ancho deseado de 100 nm para proporcionar propiedades antibacterianas y osteointegración y proporcionar suficiente espacio para la deposición de agentes antimicrobianos en los nanotubos. Este método permite la combinación de diferentes composiciones antimicrobianas para mejorar los efectos antimicrobianos y osteointegradores sinérgicos. El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos antimicrobianos de las superficies recién formadas y evaluar el crecimiento de las células osteoblásticas en un estudio in vitro. Comparamos la adhesión bacteriana, la formación de biopelículas y el crecimiento de células osteoblásticas de nanotubos de TiO2 dopados con selenio y plata con superficies de titanio regulares y nanotubos de TiO2 dopados con HA.

Se investigaron más a fondo las superficies de discos de titanio con modificaciones en términos de TNT y pTNT y deposición electroquímica adicional de Se, Ag y HA con respecto a las características de la superficie. El análisis de composición elemental mediante EDX mostró una cantidad de Se en las superficies de los discos SepTNT y SepTNT-HA de un% en peso medio de 29,9 ± 6,4% en peso. La cantidad media de Se y Ag en las superficies del disco Ag2SepTNT fue de 17,8 ± 5,4% en peso y 18,8 ± 9,4% en peso respectivamente. El % en peso de Ag medio en las superficies del disco Ag-pTNT fue de 6 ± 2 % en peso. La visualización de la superficie de los discos se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de barrido (SEM; ZEISS SIGMA HD VP) equipada con una fuente de emisión de campo Schottky para una mayor resolución espacial (Fig. 1). Ya se ha publicado más información sobre las características y propiedades de la superficie de la presente modificación de superficie28.

Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) de las superficies de los discos: (A) control sin modificaciones; (B) nanotubos de titanio dopados con fosfato (pTNT); (C) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio (SepTNT); (D) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato recubiertos con hidroxiapatita (HA); (E) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio y revestimiento de hidroxiapatita (SepTNT-HA); (F) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con plata y selenio (Ag2SepTNT).

Después de incubar las muestras con S. epidermidis y sonicar para separar las células bacterianas, se evaluaron UFC/mL en placas de agar. Se pudo detectar un recuento de células bacterianas significativamente menor para SepTNT (0,97 ± 0,18 × 106 UFC/mL; P = 0,001), SepTNT-HA (1,2 ± 0,39 × 106 UFC/mL; P = 0,001), AgpTNT (1,36 ± 0,42 × 106 UFC/mL; P = 0,002) y Ag2SepTNT (0,999 ± 0,12 × 106 UFC/mL; P = 0,001) en comparación con el control no modificado (2,2 ± 0,21 × 106 UFC/mL). La Figura 2 abarca todos los experimentos bacterianos (UFC, biopelícula y tinción de fluorescencia) de este estudio. La Figura 3 muestra los resultados del experimento de recuento de UFC. La adhesión de células bacterianas fue significativamente menor en SepTNT (38 ± 12%; P = 0,004), pTNT (47 ± 6%, P = 0,040), AgpTNT (25 ± 2%; P < 0,001) y Ag2SepTNT (15 ± 5%; P < 0,001) en comparación con el control no modificado (74 ± 11%). Las imágenes SEM reflejan los resultados de los experimentos de recuento de bacterias. Se pueden encontrar ejemplos de imágenes SEM en la Fig. 4. Las imágenes SEM con recubrimiento de Ag (AgpTNT y Ag2SepTNT) muestran una incorporación de partículas de plata y plata-selenio con un mayor número de células bacterianas en la superficie que en las UFC. contar. Sin embargo, las células con partículas ingeridas parecían ya no viables (Fig. 4).

Adhesión de células bacterianas y formación de biopelículas: el recuento de células bacterianas (arriba a la izquierda) se evaluó cultivando S. epidermidis en los discos modificados. Después de la incubación, los discos se sonicaron y el sobrenadante se transfirió a placas de agar y se cultivó durante la noche. Las UFC/mL se evaluaron contando células con un software de procesamiento de imágenes. Formación de biopelículas en discos de titanio después de la incubación con S. epidermidis y tinción con violeta cristal (arriba a la derecha). La biopelícula se midió analizando el área cubierta con un software de procesamiento de imágenes. La adhesión de las células bacterianas se midió después de la tinción fluorescente con SYTO 9 (imagen inferior) calculando el área cubierta. Los discos modificados con selenio y plata mostraron una clara reducción en la adhesión de células bacterianas y la formación de biopelículas. (A) control no modificado; (B) nanotubos de titanio dopados con fosfato (pTNT); (C) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio (SepTNT); (D) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato recubiertos con hidroxiapatita (HA); (E) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio y revestimiento de hidroxiapatita (SepTNT-HA); (F) nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con plata/selenio (Ag2SepTNT).

Unidades formadoras de colonias de S. epidermidis después de 24 h de incubación en la superficie de los discos de titanio modificados y no modificados (control) (*P <0,05). nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporado con selenio (SepTNT), nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporado con selenio y revestimiento de hidroxiapatita (SepTNT-HA), nanotubos de TiO2 dopados con fosfato (pTNT), nanotubos de titanio (TNT), fosfato de titanio incorporado con plata nanotubos de TiO2 dopados (AgpTNT), nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con plata y selenio (Ag2SepTNT) y control no modificado (Ti6Al4V).

Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) de las superficies de los discos después de 24 h de incubación con S. epidermidis; (A) el control no modificado muestra varias colonias bacterianas; (B) Con el uso de nanotubos de TiO2 dopados con fosfato (pTNT), se observa una tendencia hacia un mayor crecimiento bacteriano; (C) la incorporación adicional de selenio (SepTNT) conduce a una reducción significativa de las colonias bacterianas; (D) el recubrimiento de hidroxiapatita (HA) no fue capaz de reducir el crecimiento bacteriano; (E) en presencia de selenio en combinación con recubrimiento de HA, se detectó una clara reducción de bacterias; (F) aunque se detectaron distintas colonias bacterianas en la superficie de los nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con plata y selenio (Ag2SepTNT), la mayoría de las bacterias no eran viables y ya ingerían partículas de plata y selenio. Sólo eran visibles unas pocas células bacterianas individuales sin ingestión de partículas.

La tinción con Crystal Violet reveló una reducción significativa en la formación de biopelículas con discos SepTNT- (22 ± 3%, P = 0,020) y Ag2SepTNT (23 ± 11%, P = 0,020) en comparación con el control no modificado (54 ± 8%). Los resultados de la tinción de biopelículas se presentan en la Fig. 5.

Cobertura de biopelícula de discos de titanio modificados y no modificados. Los nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio y plata-selenio (SepTNT, Ag2SepTNT) mostraron una reducción significativa en la formación de biopelículas, mientras que los discos recubiertos de hidroxiapatita con nanotubos de TiO2 dopados con fosfato mostraron una mayor formación de biopelículas en comparación con el control no modificado.

Después de incubar las muestras con células MG63, los discos se tiñeron con cristal violeta para medir el crecimiento de las células osteoblásticas. En comparación con el control no modificado, (57 ± 29%) los discos SepTNT-HA (93 ± 2%; 0,027) y los discos pTNT (90 ± 4%, P = 0,040) mostraron un área cubierta significativamente mayor con MG-osteoblástica. 63 celdas. No se pudo detectar ninguna diferencia en el crecimiento de células osteoblásticas en comparación con los discos recubiertos de HA (90 ± 3%). La Figura 6 muestra la cobertura con celdas MG-63 sobre los discos. Las imágenes SEM de MG-63 en las superficies de titanio se muestran en la Fig. 7.

Crecimiento de células osteoblásticas en discos de titanio modificados y no modificados. Los nanotubos de TiO2 dopados con fosfato incorporados con selenio y recubiertos de hidroxiapatita (SepTNT-HA) y los nanotubos de TiO2 dopados con fosfato (pTNT) mostraron un aumento significativo en el crecimiento de células osteoblásticas.

Imágenes de microscopio electrónico de barrido (SEM) con dos aumentos diferentes (100 × y 1000x) de las superficies de los discos después de 24 h de incubación con la línea celular osteoblástica MG-63; (A) control no modificado; (B) Las muestras con nanotubos de TiO2 dopados con fosfato (pTNT) parecen tener células osteoblásticas más viables en comparación con el control; (C) la incorporación de selenio (SepTNT) conduce a un aumento significativo en la densidad celular y las aglomeraciones; (D) el recubrimiento de hidroxiapatita (HA) sobre pTNT mostró más células osteoblásticas pero menos aglomeraciones; (E) el pTNT de selenio en combinación con HA mostró una formación de células osteoblásticas singulares, pero pareció que se detectó menos aglomeración; (F) Ag2SepTNT mostró menos crecimiento de células osteoblásticas en comparación con SepTNT.

La necesidad de nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la IAP se está volviendo más importante a medida que aumenta la incidencia de complicaciones sépticas después de la AET debido al creciente número de AET y artroplastias de revisión5. Las modificaciones de las superficies de los implantes de titanio para mejorar el potencial antimicrobiano son uno de esos enfoques preventivos novedosos. En este estudio informamos sobre resultados prometedores con respecto a la reducción del crecimiento de S. epidermidis en superficies de titanio modificadas electroquímicamente mediante el uso de compuestos de plata y selenio junto con la formación de nanotubos de titanio.

Este estudio muestra varias limitaciones y nuestros resultados deben ponerse en perspectiva relativa a estos factores:

En primer lugar, este estudio es un estudio in vitro y solo ofrece una confiabilidad limitada para traducir estos hallazgos en el entorno de aplicación clínica real. Especialmente, el potencial osteogénico de las superficies modificadas necesita un análisis más profundo en términos de evaluación inmunohistológica y biomecánica en modelos in vivo. Además, para investigar la respuesta del huésped a los implantes modificados, se necesitan estudios en animales para proceder con la traducción a estudios clínicos en humanos. En segundo lugar, debido al alto costo de fabricación de los discos modificados, no pudimos investigar otros patógenos y más puntos de tiempo después de la incubación, lo que podría haber mostrado resultados diferentes a los descritos en este estudio. En tercer lugar, en un entorno de estudio in vitro no es posible investigar los posibles efectos secundarios debidos al recubrimiento de selenio de los discos de titanio. Sin embargo, existen informes sobre el uso de la aplicación intravenosa de selenito de sodio en dosis altas en pacientes críticos y no se pudieron detectar efectos secundarios adversos30. Sin embargo, parece inevitable que se necesiten más investigaciones en términos de un entorno de estudio en animales antes de dar más predicciones para el uso clínico de modificaciones de la superficie de selenio/nanotubos para implantes humanos.

La nanoestructuración de superficies de titanio en forma de nanotubos ya ha llamado la atención en el pasado por mejorar la adhesión celular, el crecimiento y la diferenciación de las células formadoras de hueso31,32,33. Y los nanotubos de TiO2 ya se utilizan en la superficie de los sistemas convencionales de artroplastia total de rodilla no cementados y muestran un comportamiento osteointegrador y efectos antimicrobianos mejorados33. Peng et al. describen en su estudio que la formación de nanotubos en las superficies de titanio conduce a una disminución del crecimiento de S. epidermidis34. En nuestro estudio, los nanotubos de TiO2 (pTNT y TNT) mostraron una tendencia hacia una menor adhesión de S. epidermidis en comparación con la superficie de titanio no modificada después de 24 h de incubación. Sin embargo, la razón por la que no vimos efectos distintos en la reducción de células bacterianas podría deberse al diferente tamaño de los nanotubos en nuestro estudio (100 nm). Sin embargo, en trabajos anteriores de nuestro grupo de estudio pudimos ver una mayor formación de biopelículas con diámetros de tubo de 70 nm. Un diámetro de tubo de 100 nm mostró una disminución en la biopelícula bajo investigación SEM28.

Para mejorar el potencial antimicrobiano de las superficies de los nanotubos de TiO2, se han publicado varios estudios con recubrimientos/rellenos adicionales de nanotubos35. Ya en 2007, Popat et al. pudieron mostrar una disminución del crecimiento de S. epidermidis con nanotubos de TiO2 rellenos de gentamicina. No obstante, con el creciente problema de la resistencia a los antibióticos, creemos que es de vital importancia para estrategias antimicrobianas alternativas para la PJI. Por ello, se ha introducido el uso de diferentes sustratos antimicrobianos como plata o cobre como material de recubrimiento. La plata ha mostrado efectos antimicrobianos auspiciosos y se usa ampliamente en implantes de artroplastia para pacientes con alto riesgo de desarrollar una IAP, como los sistemas megaprotésicos y de artroplastia de revisión26. Sin embargo, debido a la toxicidad16, no es posible un uso generalizado de la plata como agente preventivo en el reemplazo articular total primario y, por lo tanto, solo se limita a la artroplastia de revisión y la reconstrucción después de la resección del tumor. Además, debido a los efectos tóxicos, el recubrimiento de plata solo se puede aplicar en partes del implante que no están en contacto directo con el hueso26. En nuestro estudio, la mayor reducción del crecimiento bacteriano se observó con una combinación de nanotubos dopados con plata y selenio. Especulamos que esto podría deberse al mecanismo antimicrobiano subyacente del TNT y la deposición de plata y selenio que crea un ambiente de efectos antimicrobianos sinérgicos: primero, el TNT es capaz de disminuir la adhesión bacteriana debido a las propiedades de su material (hidrofilicidad, estructuras tubulares, rugosidad) que previenen aglomeración bacteriana al tiempo que aumenta el crecimiento de células osteoblásticas10. Nuestro grupo de estudio pudo mostrar dos mecanismos diferentes: una formación catalítica espontánea de especies reactivas de oxígeno (ROS) en términos de H2O2 en superficies de seleniuro de plata en presencia de oxígeno debido a las propiedades de la superficie y la liberación de plata (tóxica), iones de cobre y selenio en condiciones reductoras29. Por lo tanto, creemos que nuestros hallazgos son cruciales para resaltar los mecanismos sinérgicos beneficiosos para reducir el crecimiento de células bacterianas en las superficies de titanio. Además, estos hallazgos también podrían ser útiles para reducir las concentraciones de plata a niveles tóxicos más bajos sin afectar el antimicrobiano debido a la combinación de selenio.

El uso de selenio para el recubrimiento antimicrobiano de implantes ortopédicos ya ha sido descrito por Holinka et al.27. En su estudio, los autores encontraron una disminución del crecimiento bacteriano de S. aureus y S. epidermidis con diferentes concentraciones de selenito de sodio. Además, los autores no describen ninguna disminución en el crecimiento de las células osteoblásticas MG-63. El uso de la combinación de nanotubos de TiO2 y selenio ha sido descrito en un estudio reciente de Bilek et al.24 y sus hallazgos son congruentes con los de nuestro estudio. Sin embargo, creemos que recubrir superficies mediante simples métodos de inmersión27 o lavado24 no garantiza necesariamente una distribución constante y equitativa de partículas de selenio en toda la superficie. Por lo tanto, nuestro método propuesto ha demostrado ser confiable para llenar los nanotubos de titania con la cantidad deseada de selenio de manera estandarizada28. Además, un estudio reciente de nuestro grupo reveló que el efecto antibacteriano de los seleniuros (Ag2Se, Cu2Se) podría estar relacionado tanto con la liberación de iones como con la reacción de reducción indirecta de oxígeno (ORR) que forma especies oxidativas de H2O229. Curiosamente, las imágenes SEM, como marcador cualitativo, mostraron una correlación considerable con los recuentos de UFC. Sin embargo, las superficies de Ag2SepTNT mostraron más bacterias en las imágenes SEM que con los recuentos de UFC detectados (Fig. 4). Al observar más de cerca las imágenes SEM, encontramos que muchas colonias bacterianas ya mostraban coloides intracelulares de Ag2Se (Fig. 8). Por lo tanto, especulamos que, de manera similar al efecto bactericida de la plata, el Ag2Se deteriora la membrana celular e interactúa con el ADN bacteriano, lo que provoca la muerte bacteriana.

Imagen SEM y perfiles EDX del disco Ag2SepTNT que muestran compuestos de Ag2Se dentro de las células bacterianas.

Curiosamente, con los nanotubos recubiertos de HA encontramos un recuento de UFC casi similar y una formación de biopelículas incluso mayor en comparación con el control no modificado. Creemos que esto se debe al tamaño de las partículas de HA que casi cubren el orificio de los nanotubos y, por lo tanto, podrían obstaculizar el efecto antimicrobiano de los nanotubos. Debido a las propiedades mecánicas del HA, es posible que la biopelícula no se desprenda tan fácilmente. Este fenómeno también fue observado y confirmado en otros estudios36,37. Además, HA cubrió el orificio de TNT, lo que podría reducir el potencial antimicrobiano del TNT. Curiosamente, cuando se depositó selenio (SepTNT-HA), aumentó el potencial antibacteriano. Por lo tanto, no fomentamos el uso combinado de nanotubos de HA y TiO2 con nuestro método propuesto. McEvoy et al. encontraron resultados similares con respecto a un mayor crecimiento bacteriano en alambres de Kirschner recubiertos de HA en comparación con alambres de Ti6Al4V no recubiertos38.

Según nuestros hallazgos, el uso de nanotubos de TiO2 dopados con selenio no tiene ninguna influencia sobre el crecimiento de las células osteoblásticas en comparación con las superficies de titanio normales. Hay informes de que el crecimiento de las células osteoblásticas mejora con el uso de nanotubos39,40. Sin embargo, la formación ósea y los niveles de expresión genética relacionados con los huesos aumentaron cuando se utilizaron diámetros de aproximadamente 70 nm. En nuestro estudio utilizamos 100 nm deliberadamente para reducir la formación de biopelículas. No obstante, seguimos pensando que estos hallazgos son prometedores, ya que el crecimiento de las células osteoblásticas no se ve afectado con el método de modificación de la superficie aquí presentado, al tiempo que mejora el potencial antimicrobiano. Algunos estudios incluso informan sobre un aumento de la adhesión de las células de los osteoblastos con la incorporación de selenio en la superficie del titanio41 y, como se mencionó anteriormente, el uso de nanotubos de titanio ha demostrado tener un mayor potencial osteointegrador31,32,33. Sin embargo, dado que diferentes estudios utilizan diferentes líneas celulares osteoblásticas, es posible que estos hallazgos no sean exactamente comparables entre sí. Además, según nuestros datos, la formación de nanotubos de TiO2 no reduce suficientemente la adhesión bacteriana. La adición de agentes antimicrobianos como selenio y/o plata mejora drásticamente el potencial antimicrobiano de la superficie modificada con nanotubos de TiO2.

La razón por la cual el seleniuro de plata combinado con nanotubos de TiO2 muestra la mejor reducción bacteriana es compleja y podría estar relacionada con el efecto sinérgico de la plata y el selenio que promueven la formación de especies reactivas de oxígeno, cuando están en un compuesto. Al efecto observado contribuyen una liberación lenta de iones metálicos antibacterianos y la topografía de la superficie, predeterminada por la estructura de los nanotubos. La formación de H2O2 y la liberación de iones metálicos, provocadas por la disolución, aumentan la permeabilidad de la membrana bacteriana y, en última instancia, deterioran el ADN bacteriano. La combinación de selenio y plata en compuestos también podría tener el beneficio de reducir los niveles tóxicos potenciales de los iones liberados en comparación con el uso de metales puros por separado.

En conclusión, en este estudio mostramos el potencial antimicrobiano y osteointegrador de una nueva modificación de la superficie con nanotubos de TiO2 y la posterior incorporación de agentes antimicrobianos adicionales. Esto conduce a una disminución significativa del crecimiento bacteriano en SepTNT, SepTNT-HA, AgpTNT y Ag2SepTNT y a una cobertura de área significativamente mayor con células osteoblásticas MG-63 para superficies de SepTNT-HA y pTNT en comparación con los controles no modificados. Estos hallazgos son de vital importancia, ya que se pudieron detectar efectos sinérgicos del selenio y la plata junto con los nanotubos de titanio, que pueden aumentar el potencial antimicrobiano de estas modificaciones superficiales. Además, la hidroxiapatita incorporada en las superficies de nanotubos de titanio muestra un potencial osteointegrador mejorado, mientras que los efectos antibacterianos disminuyen con la adición de hidroxiapatita en las superficies de nanotubos. Estos hallazgos son fundamentales para futuras investigaciones en términos de experimentos dinámicos in vitro e in vivo para encontrar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir la PJI en el futuro.

La modificación electroquímica de la superficie se basa en trabajos previos del grupo de estudio y ya se describió en detalle28. Brevemente, se molieron, pulieron, desengrasaron y limpiaron discos de titanio (Ti6Al4V) con un diámetro de 10 mm y 1–2 mm de espesor con etanol y agua desionizada. La formación de nanotubos en la superficie de los discos se creó mediante anodización a un potencial constante de 30 V en una configuración de dos electrodos con los discos como ánodo y una lámina de Pt como contraelectrodo. Se han utilizado electrolitos a base de etilenglicol que contienen 10 % en volumen de agua bidestilada, NH4F 0,12 M y (NH4)NaH(PO4)·4H2O 10 mM. Investigaciones anteriores han demostrado que los electrolitos a base de etilenglicol tienen el potencial de dar forma a nanotubos uniformes28. Después de la anodización, los discos se limpiaron mediante ultrasonidos en etilenglicol y posteriormente se recocieron en aire (450 °C, 2 h) para transformar las fases de TiO2 en anatasa para completar la formación de nanotubos (TNT) y nanotubos dopados con fosfato (pTNT). en la superficie de titanio de los discos.

La deposición electroquímica de selenio (Se), plata (Ag) y seleniuro de plata (Ag2Se) en el pTNT preparado se llevó a cabo en una configuración de tres electrodos. pTNT sirvió como contraelectrodo y Ag/AgCI como electrodo de referencia. El selenio se depositó mediante pulsos catódicos en un electrolito Na2SeO3. Se depositó seleniuro de plata a partir de una solución que contenía NaSCN 0,5 M, AgNO3 5 mM y Na2SeO3 2,5 mM. Además, un conjunto de discos de Se-pTNT y pTNT se recubrieron aditivamente con hidroxiapatita (HA) mediante precipitación asistida electroquímicamente a partir de Ca(NO3)2·4H2O 2,5 mM y (NH4)NaH(PO4)·4H2O 1,5 mM con y sin Na2SeO328 2,5 mM. Después de modificaciones electroquímicas de la superficie, las superficies preparadas se utilizaron para pruebas in vitro adicionales:

Ti6Al4V (control), pTNT, TNT, pTNT-HA, SepTNT, SepTNT-HA, AgpTNT, Ag2SepTNT. Las concentraciones de Se y Ag en el área de la superficie se determinaron escaneando un área seleccionada al azar en la superficie de los discos con un detector acoplado de rayos X de dispersión de energía (EDX), TEAM OCTANE PLUS Versión 4.3. y expresado como porcentaje medio de la composición del componente (% en peso, %). Se han llevado a cabo y se han publicado previamente una caracterización adicional de las propiedades y características de la superficie, incluida la composición elemental mediante mapeo EDX, la composición química mediante espectroscopia RAMAN y el perfil de liberación de iones mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)28,29.

En este estudio se utilizó una cepa formadora de biopelículas de Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) (DSM 3269; Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmBH, Leibnitz, Alemania). Las bacterias se cultivaron durante la noche a 37 °C en placas de agar Columbia con 5% de sangre de oveja (Biomerieux, Craponne, Francia) y se almacenaron a 4 °C. Para cada experimento se inoculó una nueva placa de agar sangre con la cepa y se incubó durante la noche. De esta placa se utilizó una suspensión bacteriana en solución salina al 0,9% con una densidad óptica de McFarland 0,5 y luego se diluyó 1:100 en caldo Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missuouri) (aproximadamente 1 × 106 células/ ml) para experimentos de recuento de células bacterianas y formación de biopelículas.

Los discos de cada recubrimiento se utilizaron para el experimento dos veces por triplicado. Los discos se colocaron en una placa de 24 pocillos y en cada pocillo se transfirió 1 ml de la suspensión de células bacterianas descrita. Las placas de pocillos se sellaron y se incubaron a 37 °C en aire ambiente durante 24 h. Después de la incubación, los discos se lavaron dos veces con PBS (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missuouri). Posteriormente los discos fueron sonicados en PBS (Bandelin Sonorex Super RK 100) a una intensidad de 44 kHz durante 10 min. El fluido de sonicación resultante (10 ml) se sembró en alícuotas de 1 ml en placas de agar Columbia y se incubó nuevamente a 37 °C en aire ambiente durante 24 h. Después de la incubación, se tomaron fotografías de las placas y se contaron las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (UFC/mL) con el software ImageJ (versión 2.1.0). Se incubó un triplicado adicional de discos con suspensión bacteriana en placas de 24 pocillos a 37 °C en aire ambiente durante 24 h. Después de la incubación, los discos se lavaron cuidadosamente en PBS y se fijaron con metanol. Posteriormente, las superficies de los discos se analizaron nuevamente mediante SEM para visualizar la adherencia bacteriana (Fig. 1).

Los discos se incubaron con suspensión bacteriana como se describe anteriormente. Después de una incubación durante 24 h a 37 °C, los discos se lavaron cuidadosamente dos veces en agua destilada. Se añadió una solución de 3 µl de SYTO 9 a 1 ml de agua esterilizada por filtración. Los discos se lavaron suavemente en PBS (3 ml, tres veces) y se agregaron 750 µl de solución de tinción al disco. Se cubrió el recipiente de tinción y las muestras se incubaron durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente protegidas de la luz. Después de la incubación, las muestras se enjuagaron nuevamente con agua esterilizada con filtro y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Microscopio de contraste de fase de fluorescencia Zeiss Axioplan 2, Carl Zeiss, Jena, Alemania) con un aumento de 10 ×.

Se incubaron nuevamente discos adicionales (por triplicado) con suspensión bacteriana, luego se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta al 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) durante 15 minutos, se lavaron nuevamente con agua destilada y se secaron al aire. Posteriormente, se tomaron fotografías de los discos en condiciones estandarizadas (fondo, iluminación, distancia a la lente) y se realizó el cálculo del área cubierta utilizando el software ImageJ (versión 2.1.0). La tinción se llevó a cabo dos veces por triplicado para cada recubrimiento.

Para detectar cualquier influencia sobre el crecimiento de las células osteoblásticas, se cultivaron células MG-63 de la línea celular osteoblástica adquiridas en la American Type Culture Collection (ATCC, EE. UU., VA, CRL-1427) en matraces de cultivo de tejidos de 25 cm2 (Falcon; Thermo Fisher Scientific, Slangerup , Dinamarca) en Alpha-MEM (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania) con 10% de FCS en atmósfera humidificada con 5% de CO2 e incubado a 37 °C. A aproximadamente el 70% de confluencia, las células se separaron con tripsina/EDTA (Gibco™, Thermo Fisher Scientific, Slangerup, Dinamarca) y se diluyeron en Alpha-MEM + FCS para obtener la concentración final de 1,5 x 105 células/ml. Se inoculó 1 ml de la solución en cada disco de titanio y se incubó durante 24 h en atmósfera humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Después de la incubación, los discos se lavaron en agua destilada y se fijaron con metanol durante 10 min. Los discos se lavaron en agua destilada, se tiñeron con cristal violeta durante 15 minutos, se lavaron nuevamente con agua destilada y se secaron al aire. Posteriormente, se tomaron fotografías de los discos en condiciones estandarizadas (fondo, iluminación, distancia a la lente) y se realizó el cálculo del área cubierta utilizando el software ImageJ (versión 2.1.0). La tinción se llevó a cabo dos veces por triplicado para cada recubrimiento.

Los resultados se presentan como media y desviación estándar (DE). Las variables numéricas (UFC/mL, área cubierta en %) se analizaron mediante un análisis de varianzas unidireccional (ANOVA) y se compararon mediante una prueba post-hoc de Tukey-HSD. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos con un valor de P <0,05. El análisis estadístico se realizó con SPSS 26.0.0.1 (SPSS Inc. IBM, Chicago, EE. UU.).

Todos los autores declaran que no existen intereses competitivos relacionados con este estudio. RW recibe regalías de DePuy Synthes (Varsovia, IN, EE. UU.) y Stryker (Kalamazoo, MI, EE. UU.) fuera del trabajo presentado.

Cada autor certifica que su institución aprobó el protocolo de estudio para esta investigación y que todas las investigaciones se realizaron de conformidad con los principios éticos de la investigación.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y en sus archivos de información complementarios.

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Kevin Staats, Magdalena Pilz, Reinhard Windhager y Johannes Holinka

Centro de competencia de tecnología electroquímica de superficies (CEST GmbH), Wiener Neustadt, Austria

Jie Sun y Tzvetanka Boiadjieva-Scherzer

Instituto de Tecnología y Análisis Químicos, Universidad Técnica de Viena, Viena, Austria

Hermann Kronberger

Departamento de Medicina Interna I, División de Enfermedades Infecciosas y Medicina Tropical, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria

Selma Tobudic

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Correspondencia a Kevin Staats.

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Staats, K., Pilz, M., Sun, J. et al. Potencial antimicrobiano y crecimiento de células osteoblásticas sobre superficies de titanio modificadas electroquímicamente con nanotubos e incorporación de selenio o plata. Informe científico 12, 8298 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11804-6

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Recibido: 24 de enero de 2022

Aceptado: 05 de abril de 2022

Publicado: 18 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11804-6

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