Un generador electroquímico de óxido nítrico para in | Grupo de ánodos de titanio ICCP de Baoding

BMC Medicine volumen 20, número de artículo: 481 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El NO inhalado es un vasodilatador pulmonar selectivo que ha demostrado ser terapéutico para pacientes con hipertensión de la arteria pulmonar (PAH). El sistema de administración de NO más común en la práctica clínica se basa en cilindros, pero lamentablemente está limitado por sus altos costos, su entrega complicada y el requisito de una cadena de suministro extensa, lo que deja enormes necesidades médicas insatisfechas en todo el mundo.

Abordar la necesidad de una producción rápida, asequible y segura de óxido nítrico (NO) para la terapia de inhalación en el hogar en pacientes con HAP. Desarrollamos un novedoso dispositivo portátil para obtener NO a partir de una solución de complejo de nitrito con un catalizador de ligando de cobre (II) y examinamos más a fondo su eficacia en un modelo porcino de HAP. Este modelo se estableció utilizando cerdas miniatura Bama y se indujo mediante la administración de monocrotalina (MCT).

Este generador podría producir NO terapéutico de forma rápida y segura en concentraciones que oscilan entre 0 y 100 partes por millón (ppm) con el dióxido de nitrógeno (NO2) y sus subproductos menos desproporcionados. Podría aliviar eficazmente la presión arterial pulmonar (PAP) y la resistencia vascular pulmonar (PVR) en lechones con HAP, sin causar alteraciones fisiológicas importantes.

Nuestro generador electroquímico de NO es capaz de producir las dosis de NO deseadas para la vasodilatación pulmonar de forma segura y sostenible, con bajos costos, lo que allana el camino para sus posteriores ensayos clínicos en el paciente con HAP y otras afecciones cardiopulmonares comunes con alta carga de enfermedad. alrededor del mundo.

Informes de revisión por pares

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es un síndrome clínico grave caracterizado por una remodelación vascular pulmonar progresiva y un aumento de la presión arterial pulmonar (PAP) [1]. A pesar del desarrollo de nuevas terapias médicas, el pronóstico a largo plazo de los pacientes con HAP sigue siendo poco satisfactorio, especialmente en los lactantes con HAP idiopática y en los adultos con HAP obstinada [2, 3]. El control deficiente de la PAP es un factor de riesgo importante de muerte prematura entre los pacientes con HAP. Por diversas razones, muchos pacientes con HAP tienen un control subóptimo de la PAP. Para estos pacientes con HAP, existe una necesidad urgente de terapias confiables y sostenibles para el manejo domiciliario de la presión pulmonar.

Los medicamentos actuales de primera línea para la HAP son agentes vasoactivos como sildenafil, nitroprusiato y bosentán [1], pero el uso de estos medicamentos se asocia con vasodilatación sistémica que puede provocar hipotensión arterial a largo plazo. Desde principios de la década de 1990, el óxido nítrico (NO) gaseoso surgió como el primer vasodilatador selectivo verificado que se dirige a la vasculatura pulmonar para ejercer un potente efecto vasodilatador. El NO generalmente es liberado por las células endoteliales y aumenta los niveles de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) al activar la vía de la proteína quinasa G (PKG), relajando así las células del músculo liso vascular pulmonar sin causar hipotensión sistémica [4, 5]. En 1999, la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) aprobó el NO inhalado para el tratamiento de la hipertensión pulmonar persistente en recién nacidos (PPHN) [6]. Estudios recientes han indicado que el NO inhalado también podría aplicarse en pacientes con lesión por isquemia-reperfusión [7, 8], enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [9], inserción de un dispositivo de asistencia ventricular izquierda [10], hemólisis intravascular [11 ] y cardiopatías congénitas [12], así como en la terapia respiratoria COVID-19 [13]. En la actualidad, la comunidad médica utiliza ampliamente los sistemas de administración de NO basados en cilindros debido a su confiabilidad y seguridad [14]. Sin embargo, el uso de cilindros de gas NO se ha restringido a unos pocos entornos clínicos para pacientes hospitalizados debido a su volumen y dependencia de una fuerza laboral especializada y una red de suministro complicada, lo que genera costos médicos muy altos [15]. Aunque se ha probado un tipo de cilindro de NO en miniatura de 0,16 L, INOpulse, en escenarios clínicos ambulatorios [16], todavía está lejos de ser ampliamente utilizado en terapia en el hogar debido a su limitada capacidad de almacenamiento de NO. De hecho, tratar a pacientes con HPPRN con cilindros de NO durante cinco días puede costar una media de 14.000 dólares [14]. Por lo tanto, los cilindros de NO no son adecuados para condiciones que requieren un manejo a largo plazo de la HAP y son mucho menos accesibles en países con recursos limitados.

En los últimos años, los generadores de NO han surgido como una alternativa a los cilindros de NO, como por ejemplo los generadores basados en descarga por impulsos o reducción de NO2 [17]. Sin embargo, los generadores de NO que dependen de la descarga por impulsos no han pasado de la etapa preclínica debido a defectos críticos, como una producción insuficiente de NO y subproductos tóxicos inevitables, incluidas las partículas de NO2/O3/metal de latón. Además, la demanda de descargas de alto voltaje plantea preocupaciones de seguridad que impiden su uso en el hogar. Aunque los generadores químicos están diseñados para suministrar la concentración deseada de NO mediante la reducción del NO2 producido por el tetróxido de dinitrógeno (N2O4) [18], estos aparatos todavía no son adecuados para la terapia en el hogar debido a la toxicidad del N2O4. Por lo tanto, la generación electroquímica de NO a partir de una solución compuesta ha surgido como un diseño prometedor con mayor capacidad de producción de NO, menor producción de subproductos tóxicos y menores costos.

En este estudio, propusimos un diseño novedoso para un generador de NO portátil, asequible y práctico (generador electroquímico de NO, ENG) basado en la electrólisis de una solución de complejo nitrito/Cu(II) para generar NO gaseoso, y se evaluaron su seguridad y eficacia. investigado utilizando modelos porcinos de HAP. Este modelo se establece utilizando el cerdo miniatura Bama, porque sus características fisiológicas de presión de la arteria pulmonar y patrones de reducción de la resistencia vascular son similares a los de los humanos.

El objetivo de este estudio fue diseñar un generador de NO portátil y altamente integrado capaz de producir NO de forma rápida, estable y segura mediante la reducción electroquímica de una solución de nitrito/ligando Cu (II) de bajo costo. Además, conectamos la máquina con el ventilador para monitorear la concentración en tiempo real de NO y NO2 en la tubería y validar su eficacia para la terapia inhalatoria para la HAP en un modelo porcino. Para el modelo de HAP inducida por monocrotalina (MCT), los lechones se asignaron al azar a los grupos MCT o vehículo. En el estudio del tratamiento con NO, los animales fueron asignados aleatoriamente a diferentes grupos. El tamaño de la muestra en estudios con animales se determinó sobre la base de informes de estudios anteriores y nuestra experiencia pasada utilizando este modelo animal. Todos los experimentos in vivo se realizaron tres veces. Se utilizaron enfoques ciegos en los análisis histopatológicos. Los experimentadores no estaban cegados a la identidad de los grupos de estudio. El estudio en animales se ajusta a los principios descritos en las directrices ARRIVE [19].

En el primer modo, los materiales de membrana generadores de nitrógeno en la unidad de producción de nitrógeno (N2) contenían una o al menos dos combinaciones de poli(4-metil-1-penteno), policarbonato bromado, polipropileno, poliimida y polidimetilsiloxano. El tamaño medio de los poros de la película de nitrógeno fue de 0,005 a 0,02 μm. El flujo de nitrógeno fue controlado por un controlador de flujo másico a 0,2-0,5 L/min. A la solución que contenía tampón HEPES 0,5 M (pH 7,3) y NaNO2 1 M, se agregaron sulfato de cobre 7 mM y Me3TACN 7 mM como materias primas para la generación electroquímica de NO y se ensamblaron en un módulo electrolítico externo. Se utilizó como electrodo de trabajo una malla de Au de 5 por 10 cm y se sumergió completamente en la solución. El NO purgado y filtrado se almacenó en un tanque con N2 gaseoso para evitar la transformación del NO en óxidos de nitrógeno. El NO se liberó mediante un controlador de flujo másico en el depurador de NO2, que comprende un portador recubierto con ácido ascórbico. El segundo modo lo establecía la válvula de conmutación, en la que la solución del complejo nitrito/Cu(II), junto con el NO restante, circulaba continuamente a través de un dializador de fibra de silicona de extracción de gas utilizando una microbomba de líquido. El NO acuoso residual se separó a través de la pared de fibra de silicona debido a su alta permeabilidad y fue arrastrado por el gas portador hacia el absorbente de NOx.

La concentración de NO/NO2/O2 se controló mediante un sensor de gas de quimioluminiscencia (Honeywell, EE. UU.) integrado en el generador de NO y se mostró directamente en el panel de operación. Según los datos de monitoreo en tiempo real, la concentración de NO se puede ajustar al nivel terapéutico en cualquier momento operando la perilla.

Según la organización internacional de normalización (ISO) 18562-3:2017, utilizamos un cromatógrafo de gases para medir el contenido de compuestos orgánicos volátiles (COV) a 25 °C y una humedad del 40 al 60 % [20]. Se tomaron muestras de flujo de aire 100 min en la ejecución inicial, 24 h después del trabajo y 7 días después del trabajo. Se recogieron un total de 10 litros de gas en 100 minutos para cada muestra de prueba de COV para alcanzar el límite de detección de 2 μg/m3. Otros COV se cuantifican según la relación entre el área del pico y el área del tolueno. El ENG está clasificado como un dispositivo médico para uso en exposición a largo plazo. Con base en el umbral de preocupación toxicológica recomendado por ISO, calculamos los COV inhalados acumulativos utilizando ENG en volúmenes respiratorios diarios para adultos (20 m3/día), niños (5 m3/día), bebés (2 m3/día) y recién nacidos. (0,21 m3/día) [21]. Según ISO 18562-2:2017, se utilizó un contador láser de partículas en el aire para medir materias particulares en condiciones estándar [22]. Establecimos el tiempo de muestreo durante 24 h, registramos el número de partículas de 0,3 μm, 0,5 μm, 1,0 μm, 2,5 μm, 5,0 μm y 10 μm, y luego los convertimos en pesos de partículas por unidad de volumen (μg/m3) (V=4 /3*πR3, c=PVw/L *10−6, R=radio, V= volumen de un solo tamaño de partícula, p=densidad máxima del material de muestra, w=número de partículas, L=volumen de gas, c= pesos de partículas por unidad de volumen).

Antes de realizar el experimento, numeramos los animales en la columna A y luego los agrupamos mediante el método de números aleatorios generados por computadora (Microsoft Excel). En segundo lugar, usamos la función RAND() para generar 16 números aleatorios diferentes (entre 0 y 1) en la columna B. Luego usamos la función RANK(B1, B:B) para generar 16 números aleatorios diferentes (entre 1 y 16) en la columna C. Finalmente, asignamos cada 6 números continuos de la columna C de arriba a abajo de manera ordenada en los 3 grupos de estudio determinados. Un total de dieciocho cerdas miniatura Bama hembra sanas de 3 meses de edad (de Wujiang Tianyu Biotechnology Co., LTD) (peso medio, 7,3 ± 0,4 kg) se dividieron aleatoriamente en el grupo de control (n = 6), grupo de HAP (n =6), y grupo HAP+NO (n=6). Los animales se criaron por separado en una jaula de acero inoxidable y se les proporcionó alimento y agua potable calificados. Se monitoreó la temperatura y humedad del galpón y se alternaron los ciclos de luz y oscuridad durante 12 h. A los lechones del grupo HAP/HAP+NO se les inyectó por vía intraperitoneal MCT (12 mg/kg, disuelto en alcohol al 75%) dos veces en un intervalo de 1 semana, y el grupo de control recibió alcohol al 75%. El modelo animal estuvo listo para el experimento 6 semanas después de la primera dosis (peso medio preoperatorio, 14,2 ± 1,2 kg). Para el modelo de HAP inducida por MCT, se excluyó al lechón si la PAP media era < 20 mmHg. Durante todo el experimento, se excluyeron los lechones si morían durante la operación.

Las preparaciones preoperatorias incluyeron la administración intramuscular de atropina (0,02 a 0,04 mg/kg) para inhibir la secreción glandular, Zoletil 50 (5 mg/kg) para inducir la anestesia, enrofloxacina (5 mg/kg) para prevenir infecciones y meloxicam (0,2 mg/kg). ) para analgesia. La anestesia se mantuvo con isoflurano inhalado al 1,5-3% en O2 al 50% a través de una máscara conectada con un ventilador y ENG. El grupo HAP+NO recibió una inhalación inicial de NO (20 ppm) durante 4 h, y luego la concentración se disminuyó en 5 ppm cada 30 min hasta alcanzar finalmente 1 ppm y se mantuvo durante 30 min. La hemodinámica se midió en animales anestesiados utilizando un catéter Swan-Ganz 5F, y las señales se adquirieron mediante un sistema de procesamiento y adquisición de señales fisiológicas multicanal (RM6240E/EC, Chengdu Instrument Factory, China) a las 0 h, 0,5 h, 2 h, 6 h, y 12 h después de la operación. Los indicadores del gasto cardíaco se evaluaron mediante termodilución, que es la media de tres mediciones después de la administración intravenosa rápida de 10 ml de solución salina fría. La resistencia vascular pulmonar (PVR), el índice de resistencia vascular pulmonar (PVRI), el gasto cardíaco (CO) y el índice de gasto cardíaco (IC) se calcularon con fórmulas estándar. Además, se determinaron gases en sangre arterial (ABL90, RADIOMETER, Dinamarca), parámetros sanguíneos de rutina, parámetros bioquímicos, factores de coagulación y concentraciones de metahemoglobina en los momentos correspondientes. Los animales fueron sacrificados el día programado para la autopsia (12 h después de la operación) mediante inyección intravenosa de pentobarbital sódico a una dosis de 100 mg/kg, seguido de un examen anatómico e histopatológico. Al final del experimento se recogieron la pared del ventrículo derecho y los tejidos pulmonares. Para cada grupo experimental, todos los puntos de datos se incluyen en el análisis.

Los tejidos recolectados se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4%. Los tejidos de miocardio y pulmón se incluyeron en parafina y se seccionaron a 5 μm. Luego, las secciones se tiñeron con H&E, Verhoeff Van Gieson (EVG) y Masson utilizando kits disponibles comercialmente (Leagene) según las instrucciones del fabricante. Los cambios histológicos se observaron con un microscopio óptico (Leica).

La inmunofluorescencia se realizó siguiendo un protocolo estándar. Brevemente, los tejidos pulmonares se fijaron en paraformaldehído al 4%. Después de un gradiente de hidratación con alcohol, se usó citrato (pH = 6,5) para la reparación antigénica de las secciones de pulmón. Posteriormente, las secciones se bloquearon con suero de cabra al 5% durante 2 h y luego se incubaron con anticuerpo primario (anti-Ki67 de conejo, 1:200, No. 27309-1-AP, Proteintech; anti-α-SMA de conejo, 1:200 , No. ab5694, Abcam) a 4 °C durante la noche. Luego, las secciones se tiñeron con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las imágenes se capturaron con un microscopio confocal de barrido láser (SP8; Leica).

La proteína total se extrajo usando tampón RIPA con inhibidores de proteasa (Roche). Para el análisis de inmunotransferencia, las muestras de proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa con un sistema de transferencia seca iBlot 2 (Thermo Fisher Scientific). Las membranas se bloquearon en leche en polvo descremada al 5% en TBST (Tris 100 mmol/l, pH 7,5, NaCl al 0,9%, Tween-20 al 0,1%) durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C (anti-eNOS de conejo, 1:1000, No. ab5589, Abcam; anti-beta actina de conejo, 1:1000, No. 20536-1-AP, Proteintech; anti-PKG de conejo, 1:500, No. bs-6705R, Bioss; anti-sGC de conejo , 1:500, nº bs-13544R, Bioss). Las membranas se lavaron con TBST y se incubaron durante 1 h con anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra (1:8000, ZSGB-Bio) a temperatura ambiente. Las transferencias se revelaron utilizando ECL (Thermo Fisher Scientific) y las imágenes se capturaron con un analizador de imágenes luminiscentes (GE).

Todos los datos se presentan como media ± DE. La normalidad de las distribuciones se comprobó con la prueba de Shapiro-Wilk. Se utilizó la prueba t de Student para comparar las medias de dos grupos independientes, y se utilizó ANOVA de dos factores con medidas repetidas para determinar el efecto de respirar NO generado electroquímicamente sobre la PAP y la PVR (GraphPad Prism 7.0; GraphPad Software Inc.). P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Para satisfacer las demandas de la terapia de inhalación domiciliaria de NO en pacientes con HAP, diseñamos un generador de NO controlable basado en la reducción electroquímica de nitrito. En este novedoso dispositivo, se producen electroquímicamente cantidades sustanciales de NO en la superficie de un electrodo de malla de Au mediante la reducción de una solución de nitrito en presencia de cobre (II) 1,4,7-trimetil-1,4,7-triazaciclononano ( Cu(II)Me3TACN) sin producir subproductos tóxicos. El ENG puede producir rápidamente NO de alta pureza con una sola perilla, lo que permite su funcionamiento junto a la cama o en el hogar. Para permitir su uso portátil, el generador de NO tenía un diseño muy pequeño (41,2 cm × 38,5 cm × 19,8 cm) y sólo pesaba 15 kg en total. Este dispositivo es fácil de operar con una sola perilla y las concentraciones de gas en tiempo real de NO, NO2 y O2 se muestran en una interfaz fácil de usar (Fig. 1A).

Diseño, configuración y esquematización de un novedoso modelo ENG. A Aspecto, tamaño y configuración del ENG. B Posicionamiento detallado de cada unidad dentro del generador de NO altamente integrado. C Diagrama esquemático del ENG que consta de 4 unidades conectadas secuencialmente y dos modos de trabajo controlados por una válvula de conmutación. El generador de NO estaba conectado a la tubería del ventilador y supervisado por la placa de circuito.

El ENG altamente integrado se compone de una unidad de generación de nitrógeno, una unidad de generación de NO, una unidad de purificación y una unidad de salida (Fig. 1B). La unidad de generación de nitrógeno está ubicada en la parte inferior y contiene un dispositivo generador de nitrógeno y un dispositivo de filtrado. El aire comprimido se filtra mediante un dispositivo de filtrado para garantizar que el polvo, las partículas o el aerosol no tengan influencia en el ENG, y luego el aire ingresa al dispositivo generador de nitrógeno, donde se libera oxígeno (O2) y nitrógeno (N2). están separados por sus diferentes velocidades de permeación a través de la membrana de fibra hueca. La unidad de generación de NO está ubicada junto a la unidad de generación de nitrógeno y contiene un módulo electrolítico externo con conexión circular y una fibra de intercambio de gases incorporada. El módulo electrolítico es un consumible de fácil reemplazo y tiene capacidad de generar NO en un volumen equivalente al de cinco cilindros de NO de 8 L. La fibra de intercambio gaseoso se encarga de eliminar el NO residual del electrolito. Una unidad de purificación que consta de una película de filtración de sal, una película de Nafion y un filtro de limpieza está ubicada entre las unidades de generación y salida de NO para eliminar la niebla salina, la humedad y cualquier impureza que pueda dañar a los pacientes. La unidad de salida está ubicada en la parte superior e incluye un tanque de almacenamiento de NO y un depurador de NO2 recubierto con ácido ascórbico para reducir el NO2 a NO.

El ENG puede funcionar en dos modos (Fig. 1C). El primer modo es para la producción rápida de NO de alto flujo generado con un burbujeador de gas fritado. En este modo, el aire se comprime y se filtra en la unidad de generación de nitrógeno para lograr ≥99,0 % de N2, que se pulveriza en la celda electrolítica a través de una purga para barrer el NO generado en el tanque electrolítico. El NO purificado se mezcla con N2 en una determinada proporción en el tanque de almacenamiento y el NO2 residual se reduce a NO en el depurador de NO2. Entonces, el NO está disponible para uso médico. El ENG puede conectarse a una máscara para inhalación directa o conectarse a la salida del ventilador que es supervisado y regulado por un microcontrolador. En el segundo modo, la solución electrolítica se dirige desde la celda electrolítica y fluye a través de un tubo de reflujo revestido con una membrana de fibra de silicio, durante el cual el NO residual se extrae al absorbente de NOx. Este proceso de extracción se inicia al cambiar la válvula y evita la erosión química del electrodo por el NO residual en la solución cuando finaliza la liberación de NO.

En general, nuestro novedoso modelo de generador de NO fue diseñado para sintetizar, purificar, reciclar y liberar NO en un dispositivo compacto y portátil. Dado su pequeño tamaño y su conveniente reemplazo de consumibles, este dispositivo tiene un gran potencial para su uso en diversos entornos clínicos, incluido el tratamiento hospitalario y el uso domiciliario para pacientes con HAP.

Luego probamos la eficiencia de la producción de NO aplicando corrientes consecutivas de 10 a 90 mA en los electrodos del ENG. Se produjo una amplia gama de concentraciones de NO de 390 ppm a 3500 ppm, y el tiempo de cambio de la producción de NO fue inferior a 5 minutos (Fig. 2A). Es importante destacar que el nivel de NO aumentó de manera lineal al aumentar la corriente aplicada a los electrodos, lo que proporciona una base teórica para la liberación sostenida y precisa de NO (Fig. 2B). Para comprender la eficiencia real de la producción de gas, probamos la eficiencia de Faraday. Con una corriente de 40 mA, la eficiencia de Faraday es aproximadamente del 74%. El valor disminuye con una corriente más alta y varía entre 61 y 74 %. Además, la celda electrolítica podría generar un nivel constante de NO durante cinco períodos de tiempo consecutivos (Fig. 2C), lo que indica su excelente confiabilidad para el control preciso de la producción de NO a una concentración fija. Para confirmar la tasa de generación y la seguridad del NO liberado, monitoreamos el NO y el NO2 simultáneamente en el extremo del gasoducto. Los resultados mostraron que ENG podía alcanzar la dosis deseada de NO en 2 minutos y el NO2 estaba en una concentración extremadamente baja (<1 ppm) independientemente de la dosis terapéutica de NO (Fig. 2D). Además, el NO2 también se mantuvo en niveles extremadamente bajos en una gama más amplia de NO generado (archivo adicional 1: Tabla S1, Figura S1). De acuerdo con la evaluación de biocompatibilidad ISO 18562:2017 de las vías de gas respirable en aplicaciones de atención médica, probamos además la emisión de COV y partículas en el extremo de la tubería. Los resultados mostraron que los COV estaban por debajo del umbral de preocupación toxicológica para pacientes de diferentes edades (archivo adicional 1: Tabla S2-S5). Además, se demostró que las partículas eran inferiores a 10 μg/m3, lo que también se encuentra en los rangos de seguridad (archivo adicional 1: Tabla S6).

NO producción y monitoreo de NO2 con el ENG. Monitoreo de la concentración de NO en la solución con diferentes niveles de corriente aplicada. B La relación lineal entre la concentración de NO calibrada y las corrientes aplicadas. Niveles de C NO generados durante cinco períodos de tiempo consecutivos. D Niveles de NO2 bajo dosis terapéuticas de NO

En conjunto, estos resultados demostraron que nuestro ENG tiene una excelente capacidad para una producción eficiente, sostenible y estable de NO, con un amplio rango de ajuste y una producción mínima de subproductos.

Para examinar la eficacia del ENG para el tratamiento de la HAP, establecimos un modelo porcino mediante inyección intraperitoneal de 12 mg/kg de MCT dos veces (archivo adicional 1: Tabla S7 y Tabla S8). La tinción elástica con EVG de los tejidos pulmonares en el grupo MCT reveló un engrosamiento desigual de la capa media de las arterias pulmonares, acompañado de estenosis de la luz (flecha negra), pequeñas arteriolas pulmonares mucho más musculadas (flechas negras) e hiperplasia intersticial pulmonar con infiltración de células inflamatorias. (Figura 3A). La tinción por inmunofluorescencia con Ki67 (P <0,01, n = 3) y α-SMA (P <0,01, n = 3) de tejidos pulmonares reveló un aumento significativo de la proliferación de la pared vascular y el engrosamiento de las arteriolas pulmonares en el grupo de MCT en comparación con el grupo de vehículo ( Figura 3B). La tinción H&E del ventrículo derecho mostró edema distintivo y trastorno de los cardiomiocitos en el grupo MCT, y la tinción de Masson reveló una mayor carga de fibrosis miocárdica en el grupo MCT (P <0,01, n = 3) (Fig. 3C). Además, el grupo MCT también mostró una túnica media muy engrosada en la arteria pulmonar principal (P <0,05, n = 3) (Fig. 3D). Además, la transferencia Western mostró que los niveles de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) disminuyeron significativamente en el grupo de MCT en comparación con el grupo de vehículo, lo que indica que la síntesis endotelial de NO endógeno se atenuó en la PAH (P <0,01, n = 3) (Fig. .3E). Desde una perspectiva hemodinámica, mayor sPAP (P = 0,002, F = 1,637, gl = 10, n = 6), dPAP (P = 0,027, F = 2,384, gl = 10, n = 6), mPAP (P = 0,004, F=0,509, gl=10, n=6), PVR (P=0,001, F=3,66, gl=10, n=6) y PVRI (P=0,001, F=2,656, gl=10, n=6 ) y menor volumen sistólico (SV) (P = 0,001, F = 2,932, gl = 10, n = 6), CO (P = 0,001, F = 0,097, gl = 10, n = 6) y CI (P = 0,001, F = 6,585, df = 10, n = 6) se observaron en el grupo MCT que en el grupo de vehículo (Fig. 3F). Estos resultados sugieren que el modelo porcino de HAP inducida por MCT se estableció con éxito y podría usarse para evaluar el efecto terapéutico del ENG.

Establecimiento de un modelo de HAP porcino. Una tinción elástica de los pulmones con EVG muestra los cambios patológicos en lechones con HAP inducida por MCT y en el grupo tratado con vehículo. Las flechas indican un engrosamiento desigual de la capa media de las arterias pulmonares, con estenosis de la luz, arteriolas pulmonares muscularizadas y engrosamiento intersticial pulmonar con infiltración de células inflamatorias. B Tinción de inmunofluorescencia de Ki67 y α-SMA en secciones de tejido pulmonar incluidas en parafina de lechones con HAP inducida por MCT o del grupo tratado con vehículo. Barras de escala, 50 μm. Tinción C H&E y tinción de Masson del miocardio ventricular derecho de lechones con HAP inducida por MCT o del grupo tratado con vehículo. Barras de escala, 50 m para tinción H&E y 100 m para tinción Masson. D Tinción con EVG de la túnica media de la arteria pulmonar principal de lechones con HAP inducida por MCT o del grupo tratado con vehículo. Barras de escala, 2 mm. E Imágenes representativas y cuantificación de la expresión de eNOS en los tejidos pulmonares de lechones con HAP inducida por MCT o el grupo tratado con vehículo mediante transferencia Western. F Los datos hemodinámicos de la circulación pulmonar, incluidos sPAP, dPAP, mPAP, SV, CO, CI, PVR y PVRI, se midieron y calcularon mediante intervención con catéter en lechones con HAP inducida por MCT o en el grupo tratado con vehículo. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001; en comparación con el grupo de vehículos, según lo analizado mediante la prueba t de Student

Al utilizar un modelo porcino de PAH, exploramos más a fondo si el ENG podría reducir la PAP. Conectamos el ENG a un ventilador y registramos los cambios en la PAP con un catéter de Swan-Ganz antes y después de la inhalación de NO (Fig. 4A). En el grupo HAP+NO, los animales inhalaron NO a 20 ppm durante 4 h como dosis inicial, y la concentración de NO disminuyó a un ritmo de 10 ppm por hora en las 2 h siguientes. Después de la inhalación de NO, la expresión de guanilato ciclasa soluble (sGC) (P<0,05, n=3) y PKG (P<0,05, n=3) aumentó significativamente, lo que indica que el NO inhalado activó la vía de señalización mediada por cGMP (Fig. .4B). Como se esperaba, el análisis de gases en sangre arterial mostró que el enriquecimiento de PaO2 aumentó significativamente en comparación con 0,5 h (P <0,001), 2 h (P <0,001) y 6 h (P <0,01) después de la inhalación de NO (Fig. 4C y archivo adicional 1: Cuadro S9). En comparación con el grupo de HAP, el grupo de HAP + NO mostró niveles significativamente más bajos de sPAP (P = 0,045 a las 0,5 h, P = 0,032 a las 2 h), dPAP (P = 0,05 a las 0,5 h, P = 0,030 a las 2 h) y mPAP ( P = 0,036 a las 0,5 h, P = 0,006 a las 2 h) después de la inhalación (Fig. 4D), acompañado de mejoras consistentes en SV (P = 0,007 a las 0,5 h, P = 0,003 a las 2 h), CO (P = 0,005 a las 2 h) 0,5 h, P = 0,013 a las 2 h) y CI (P = 0,026 a las 0,5 h, P = 0,014 a las 2 h) (Fig. 4E). Además, el PVR calculado (P = 0,001 a las 0,5 h, P = 0,001 a las 2 h) y el PVRI (P = 0,007 a las 0,5 h, P = 0,001 a las 2 h) se aliviaron en el mismo momento en el grupo de HAP + NO ( Figura 4F).

El ENG alivió eficazmente la hipoxemia y mejoró la hemodinámica pulmonar en el modelo de HAP porcina. AA esquema de la conexión del ENG al ventilador y adquisición de datos hemodinámicos. B Transferencia Western para sGC y PKG en tejidos pulmonares de lechones con HAP en presencia o ausencia de inhalación de NO (n = 6/grupo). C Detección de PaO2 en lechones con HAP en presencia o ausencia de inhalación de NO o en el grupo simulado en el momento indicado (n=6/grupo). D–F La medición de PAP (D); SV, CO y CI (E); y PVR y PVRI (F). *P<0,05, **P<0,01; en comparación con el grupo de HAP, según lo analizado mediante la prueba t de Student (B) o ANOVA de dos factores con medidas repetidas (C-F)

Los análisis de sangre, la bioquímica sérica y los exámenes de coagulación no revelaron diferencias significativas (P>0,05) antes y después de la aplicación del ENG (Fig. 5A-C, archivo adicional 1: Tabla S10), lo que sugiere hepatotoxicidad y toxicidad hematológica mínimas. Después del tratamiento con ENG, la metahemoglobina en el grupo de PAH + NO permaneció en un nivel normal y no aumentó significativamente en comparación con la del grupo de PAH (P>0,05) (Fig. 5D), lo que indica que la concentración terapéutica de NO producida por el ENG no causó metahemoglobinemia. En patología, el ENG no causó lesiones significativas a los bronquiolos pulmonares ni a los bronquios terminales en lechones con PAH (Fig. 5E).

Examen de indicadores fisiológicos y patología pulmonar después de la inhalación de NO con el ENG. A – D Comparación de células sanguíneas (A); función hepática y renal (B); función procoagulante (C); y metahemoglobina (D) entre lechones con HAP tratados con ENG y los no tratados con ENG; en comparación con el grupo de HAP, según lo analizado mediante la prueba t de Student. Tinción E H&E de secciones de parafina de bronquiolos (barras de escala, 500 μm) y bronquios terminales (barras de escala, 50 μm)

En conjunto, confirmamos en un modelo de HAP porcina que el ENG puede aliviar eficazmente el compromiso hemodinámico y mejorar las funciones cardíacas a un nivel terapéutico de NO administrado sin causar alteraciones hematológicas, hepáticas ni lesiones pulmonares.

Actualmente, existen múltiples diseños de generadores de NO para terapia por inhalación, pero ninguno está disponible para uso doméstico en el tratamiento de la HAP [14]. Aquí, diseñamos un modelo novedoso de un generador de NO que obtiene NO gaseoso de una solución de nitrito mediante un método electroquímico y verificamos su eficacia y seguridad en un modelo preclínico. El ENG entregó NO en un rango terapéutico de 0 a 100 ppm en 5 min con niveles insignificantes de NO2 (<1 ppm), cumpliendo con los requisitos de calidad y seguridad establecidos por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional [23]. El módulo electrolítico clave del ENG podría mantener una producción constante de NO a 20 ppm durante al menos 7 días, y el módulo podría reemplazarse fácilmente a bajo costo. En lechones con HAP inducida por MCT, nuestro dispositivo mejoró eficazmente la hemodinámica y las funciones cardíacas sin causar alteraciones fisiológicas importantes.

Los medicamentos utilizados actualmente para el tratamiento de la HAP, ya sea que se administren por vía intravenosa, subcutánea u oral, se asocian con hipotensión sistémica dependiente de la dosis en diversos grados. Es de destacar que este efecto adverso está ausente con los medicamentos inhalados, incluidos iloprost y NO. El iloprost generalmente se administra cada 2 a 8 h con efectos terapéuticos intermitentes, mientras que el NO puede inhalarse durante un tiempo relativamente largo y mantiene efectos terapéuticos estables. Para el uso domiciliario de la terapia de inhalación de NO, la inhalación continua de dosis bajas durante el sueño podría ser una opción factible sin interferir con los pacientes en reposo. Para alcanzar este objetivo, se necesita con urgencia un generador de NO fiable diseñado para aplicaciones domésticas.

Nuestro dispositivo incorporó varias innovaciones técnicas importantes para lograr este objetivo. Primero, el ENG utiliza N2 como gas de barrido para eliminar la reacción entre el O2 y el NO recién formado, así como para evitar que el catalizador del ligando de cobre (II) se oxide en la solución cerca de los electrodos. Como resultado, la eficiencia de la generación de NO aumentó con un mayor flujo de barrido de N2. En el tanque de almacenamiento, el NO y el N2 generados se presurizan para minimizar la desproporción de NO y también permiten una salida estable y ajustable de NO altamente purificado bajo diferentes caudales del ventilador. Actualmente ajustamos el caudal entre 0,3 y 0,5 L/min, que es suficiente para satisfacer las demandas de la mayoría de los entornos clínicos. En segundo lugar, se utilizó una combinación de un electrodo inerte (Au) y una solución electrolítica que contiene Cu para la generación de NO. Al aplicar corriente de 0 a 90 mA, este método permitió la producción de NO en concentraciones que oscilaban entre 0 y 3600 ppm en la fase de solución sin producir subproductos tóxicos como el N2O, lo que mejoró en gran medida la seguridad de la aplicación clínica. En tercer lugar, se integró una membrana de fibra hueca de silicona en el dispositivo de intercambio de gases, que elimina eficazmente el NO residual de la solución electrolítica. Esta modificación mejoró la estabilidad de la pieza consumible y prolongó su vida útil para alcanzar el nivel de NO deseado, reduciendo significativamente el costo financiero del ENG.

Los cilindros de gas NO de alta presión convencionales están limitados por su alto costo, volumen y desproporción de NO después del almacenamiento durante períodos prolongados. Para superar estos problemas, se han propuesto muchas soluciones alternativas, incluidos cilindros de NO en miniatura como INOpulse, producción eléctrica de NO con descarga de chispa y la derivación de NO a partir de productos químicos como el N2O4 líquido [17, 18]. Sin embargo, la aplicación doméstica de cilindros de NO en miniatura tiene una baja tasa de aceptación en entornos clínicos debido a su engorroso procedimiento de instalación y al reemplazo frecuente de los cilindros de gas debido a la capacidad limitada de almacenamiento de NO. El dispositivo eléctrico de generación de NO tiene dificultades para mantener una producción estable de NO debido a los flujos de aire fluctuantes a través del chispero, y este dispositivo tiene un riesgo relativamente mayor de liberar productos tóxicos, tales como partículas metálicas de latón u O3. Estas preocupaciones sobre la seguridad y el rendimiento restringen la utilidad de estos dispositivos para la terapia en el hogar. La generación química de NO a partir de N2O4 líquido va acompañada de la producción de óxido de nitrógeno y partículas tóxicas que causan problemas de salud y, por lo tanto, puede no ser una opción adecuada para la terapia en el hogar. En este estudio, el gas NO liberado de nuestro modelo ENG contenía muy pocos subproductos tóxicos, y la administración de NO usando el ENG no causó metahemoglobinemia y tuvo hepatotoxicidad y toxicidad hematológica mínimas en lechones con HAP experimental. En este sentido, nuestro novedoso dispositivo ENG destaca por su capacidad de generar NO de forma segura con una toxicidad mínima y un bajo coste de consumibles, lo que lo hace adecuado para el tratamiento domiciliario de pacientes con HAP.

Debido a la falta de dispositivos de administración de NO sostenibles y económicos en el hogar, la terapia de inhalación de NO se ha restringido principalmente a entornos hospitalarios y no se considera una opción de tratamiento domiciliario para la HAP y otros escenarios clínicos. Nuestro modelo ENG versátil, portátil y económico no solo es adecuado para la terapia de cabecera para la HAP (archivo adicional 1: Figura S2), sino que también tiene el potencial de usarse para pacientes con enfermedades pulmonares crónicas, enfermedades cardíacas congénitas, COVID-19 e incluso en algunas circunstancias de emergencia. Por ejemplo, el ENG podría utilizarse para rescatar a viajeros de las tierras altas con edema pulmonar agudo debido a su pequeño tamaño y su rápida producción de la concentración de NO deseada.

Se deben abordar varias limitaciones del ENG antes de su traducción exitosa al uso médico en el hogar. Primero, la falta de una batería ensamblada puede limitar la aplicación extensiva del ENG en situaciones de emergencia. En segundo lugar, aunque el aparato es más pequeño y pesa menos que otros productos, no es lo suficientemente móvil para que los pacientes reciban la inhalación de NO deseada en cualquier momento, especialmente para los viajeros de las tierras altas.

Se diseñó y probó un modelo novedoso de generador de NO, que tiene el potencial de generar NO de alta pureza para una terapia de NO inhalable estable, continua y segura para pacientes con HAP. El dispositivo es fácil de usar y puede ser utilizado por personas sin formación especializada, lo que podría mejorar en gran medida su tasa de aceptación en la práctica del mundo real. Nuestro dispositivo puede ampliar las indicaciones de la terapia de NO inhalado en el hogar a otros escenarios clínicos, como el tratamiento de la EPOC, el edema pulmonar de gran altitud y la COVID-19. Teniendo en cuenta su alta rentabilidad, nuestro dispositivo tiene la posibilidad de abordar las necesidades médicas no cubiertas de una amplia población de pacientes en países con recursos limitados en todo el mundo. Se necesitan ensayos clínicos para probar la utilidad clínica de este novedoso dispositivo generador de NO.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Hipertensión de la arteria pulmonar

Presión arterial pulmonar

Monofosfato de guanosina cíclico

Proteína quinasa G

Óxido nítrico sintasa endotelial

Guanilato ciclasa soluble

Administración de Alimentos y Medicamentos

Hipertensión pulmonar persistente en recién nacidos

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Generador electroquímico de NO

Compuestos orgánicos volátiles

Organización Internacional de Normalización

monocrotalina

Partes por millón

Resistencia vascular pulmonar

Índice de resistencia vascular pulmonar

Salida cardíaca

Índice de gasto cardíaco

Volumen sistólico

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Apreciamos mucho la ayuda en estudios con animales del Dr. Bin Gong del Hospital Nanjing Drum Tower.

Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A2018), el Programa de Líderes Académicos Médicos Destacados de Shanghai (2019LJ22), el Programa de Vela de Shanghai (20YF1428700), el Programa Chenguang de Shanghai (20CG23), el Programa Pujiang de Shanghai (22PJ1410100) y un equipo de investigación innovador. de universidades locales de alto nivel en Shanghai

Yiwei Liu, Yifan Zhu y Chenyu Jiang contribuyen por igual.

Centro del Corazón e Instituto de Enfermedades Cardíacas Congénitas Pediátricas de Shanghai, Centro Médico Infantil de Shanghai, Facultad de Medicina, Universidad Jiao Tong de Shanghai, Shanghai, 200127, China

Yiwei Liu, Yifan Zhu, Chenyu Jiang, Yi Yan, Bei Feng, Zhuoming Xu y Hao Zhang

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Yiwei Liu, Yifan Zhu, Chenyu Jiang y Hao Zhang

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Zhanhao Su, Xiaojian Wang y Hao Zhang

Instituto de Prevención Cardiovascular (IPEK), Universidad Ludwig Maximilian Munich, 80539, Munich, Alemania

yi yan

DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular), sitio asociado Munich Heart Alliance, 80539, Munich, Alemania

yi yan

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Wen Mao y Yuyan Zhang

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Conceptualización y metodología: YL, YZ1, CJ y HZ. Adquisición de datos: YL, YZ1 y CJ. Análisis e interpretación de los datos. YL, YZ1 y CJ. Redacción del manuscrito: YL e YZ1. Administración de proyectos y software: WM, YZ2 y HZ. Visualización: ZS. Revisión y edición: YY, BF, XW y ZX. Aprobación final y adquisición de financiación: YL, YY y HZ. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Hao Zhang.

El estudio con animales fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Centro Médico Infantil de Shanghai. Todos los procedimientos y cuidados de los animales se llevaron a cabo con protocolos para animales aprobados de acuerdo con las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Composición del gas producido a partir de ENG. Tabla S2. Según el volumen respiratorio diario de los adultos, se calcula la cantidad de COV descargados que se pueden inhalar en diferentes 24 horas. Tabla S3. Según el volumen respiratorio diario de los niños, se calcula la cantidad de COV descargados que pueden inhalarse en diferentes 24 horas. Tabla S4. Con base en el volumen respiratorio diario de los bebés, se calculó la cantidad de COV descargados que se pueden inhalar en diferentes 24 horas. Tabla S5. Con base en el volumen respiratorio diario del recién nacido, se calcula la cantidad de COV descargados que se pueden inhalar en diferentes 24 horas. Tabla S6. Cantidad total de partículas emitidas desde la salida de gas ENG en 24 horas. Cuadro S7. Rutina sanguínea preoperatoria, bioquímica sanguínea y coagulación en grupo vehículo y grupo MCT. Cuadro S8. Análisis de gases en sangre arterial preoperatorios en el grupo de vehículo y en el grupo MCT. Tabla S9. Análisis de gases en sangre arterial a las 6 horas después de la inhalación de NO en el grupo PAH y en el grupo PAH+NO. Cuadro S10. Rutina sanguínea postoperatoria, bioquímica sanguínea y coagulación en el grupo HAP y grupo HAP+NO. Figura S1. Niveles de NO2 bajo un rango más amplio de dosis de NO (20-80 ppm). Figura S2. Imagen del mundo real del ENG trabajando con una máscara de presión positiva continua en las vías respiratorias (CPAP) para inhalación junto a la cama.

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Liu, Y., Zhu, Y., Jiang, C. et al. Un generador electroquímico de óxido nítrico para la terapia de inhalación en el hogar en la hipertensión de la arteria pulmonar. BMC Med 20, 481 (2022). https://doi.org/10.1186/s12916-022-02686-6

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Recibido: 24 de septiembre de 2022

Aceptado: 29 de noviembre de 2022

Publicado: 15 de diciembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-022-02686-6

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