Nanoclusters de carbonato de calcio amorfo paramagnético altamente hidratados como agente de contraste para resonancia magnética

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5088 (2022) Citar este artículo

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El carbonato de calcio amorfo juega un papel clave como precursor transitorio en las primeras etapas de la formación de carbonato de calcio biogénico en la naturaleza. Sin embargo, debido a su inestabilidad en solución acuosa, todavía hay poco éxito en la utilización del carbonato de calcio amorfo en biomedicina. Aquí, informamos el efecto mutuo entre los iones de gadolinio paramagnéticos y el carbonato de calcio amorfo, lo que da como resultado nanoclusters de carbonato amorfo paramagnético ultrafinos en presencia de un entorno similar a carbonato altamente hidratado ocluido con gadolinio y poli (ácido acrílico). Se ha confirmado que el gadolinio mejora el contenido de agua en el carbonato de calcio amorfo, y el alto contenido de agua de los nanoclusters de carbonato amorfo contribuye a una eficiencia de contraste de imágenes de resonancia magnética mucho mayor en comparación con los agentes de contraste a base de gadolinio disponibles comercialmente. Además, el rendimiento mejorado de las imágenes de resonancia magnética ponderadas en T1 y la biocompatibilidad de los nanoclusters de carbonato amorfo se evalúan más a fondo en varios animales, incluidos ratas, conejos y perros beagle, en combinación con una seguridad prometedora in vivo. En general, los nanoclusters de carbonato amorfo, excepcionalmente fáciles de producir en masa, exhiben un rendimiento de imagen excelente y una estabilidad impresionante, lo que proporciona una estrategia prometedora para diseñar agentes de contraste para resonancia magnética.

El carbonato de calcio amorfo (ACC), que existe ampliamente en la naturaleza, desempeña un papel clave como precursor transitorio en las primeras etapas de la formación de biominerales1,2,3,4. Utilizando una estrategia bioinspirada se pueden lograr diversos materiales con fase controlada y propiedades físicas y químicas5,6. El contenido altamente hidratado es una característica distintiva del ACC y juega un papel fundamental en su estabilización6,7,8,9,10,11,12. Como fase metaestable del carbonato de calcio, el ACC es inestable en solución acuosa y se transformará rápidamente en fases cristalinas debido a la deshidratación, la unión de iones y otros factores6,7,8,13. Por lo tanto, la posible aplicación de ACC altamente hidratado se ignora en gran medida y hay pocos ejemplos exitosos de utilizar ACC en biomedicina.

Un parámetro importante para mejorar el rendimiento de contraste de los agentes de contraste para RM T1 a base de gadolinio es su hidratación14. Con siete electrones no apareados, el ion gadolinio posee un gran momento magnético y un largo tiempo de relajación del espín electrónico, lo que da lugar a numerosos agentes de contraste extracelulares a base de gadolinio clínicamente disponibles para la resonancia magnética T114,15. En virtud de su funcionalización versátil para interactuar con biomoléculas in vivo y menores tasas de fuga de iones de gadolinio que se benefician de una nanoestructura inorgánica, los nanoagentes inorgánicos basados ​​en Gd atrajeron una atención considerable15,16. Desafortunadamente, la hidratación de las nanopartículas a base de gadolinio se ve afectada por la síntesis a alta temperatura, aunque la consiguiente fuga de iones se minimiza debido a la nanoestructura confinada en comparación con los complejos de quelato15.

Aquí, introducimos iones de gadolinio en el proceso de mineralización de ACC, que se ha demostrado que se integran en la fase final de carbonato de calcio amorfo. En este sistema amorfo, los iones de gadolinio junto con el poli(ácido acrílico) facilitan una mayor hidratación del agua y la estabilidad de los nanoclusters, mientras que el confinamiento de los iones de gadolinio por carbonato mejora la biocompatibilidad y el rendimiento, lo que indica que el producto resultante tiene propiedades notables como agente de contraste para resonancia magnética. Además, se descubre un efecto mutuo entre el ion lantánido paramagnético gadolinio y el carbonato de calcio amorfo, lo que contribuye al contenido hidratado maximizado en los nanoclusters compuestos amorfos preparados y a una alta relajación longitudinal. Los nanoclusters de carbonato amorfo paramagnético (ACNC) finales poseen una alta proporción de agua a Ca (agua/Ca = 7,2) en comparación con los ACC normales (las proporciones se mantuvieron constantes en aproximadamente 0,4 a 1,9). La relaxividad longitudinal de ACNC (37,93 ± 0,63 mM−1 · s−1 bajo 3,0 T) también se ha beneficiado del alto contenido de agua, que es diez veces mayor que el del agente de contraste para RM disponible comercialmente, ácido gadopentético (Gd-DTPA). y altamente resistente a la fuga de iones, por lo que puede servir como posible agente de contraste para RM.

Hasta ahora, además de diferentes tipos de aditivos orgánicos como biomoléculas y polímeros, el magnesio es el único catión inorgánico del que se ha informado que es capaz de estabilizar el ACC6,17. El ion gadolinio, cuyo radio iónico es más cercano al del ion calcio que al del magnesio, puede considerarse como un análogo del ion calcio más pequeño con mayor valencia y energía de hidratación18,19. De manera similar a la quelación entre poli(ácido acrílico) (PAA) y calcio para mejorar la estabilidad de ACC7,20, los grupos carboxilato en PAA tienen el potencial de quelar iones de gadolinio, permitiendo que el complejo unido se solidifique posteriormente en carbonato21.

Como se muestra en la Fig. 1a, se mezclaron cloruro de calcio y cloruro de gadolinio con PAA y luego se añadió una solución equimolar de carbonato de sodio con agitación intensa. Esta síntesis eficiente a temperatura ambiente demostró producir ACNC en presencia de gadolinio y PAA. Se pueden producir fácilmente dos litros de producto acuoso, lo que indica la escalabilidad y reproducibilidad del método que se presenta aquí (Fig. 1b). La presencia de grupos dispersos en solución salina normal se reflejó por el efecto Tyndall (Fig. 1c). Como se muestra en la Fig. 1d, la morfología esférica se investigó más a fondo mediante microscopía electrónica de criotransmisión (crio-TEM) y demostró ser comparable con ACC como se informó anteriormente22. Los nanoclusters observados por STEM (Fig. 1 complementaria) estaban de acuerdo con las observaciones de TEM de escaneo de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF-STEM) y el carácter amorfo de los clusters se validó mediante el análisis SAED (Fig. 1e). Los datos de EDS mostraron distribuciones uniformes de gadolinio y calcio en los agregados del grupo (Figuras complementarias 2a, b).

a Esquema del proceso de síntesis de ACNC. b Imagen digital del ACNC preparado a gran escala con un volumen total de más de 2 litros. c Imagen digital del efecto Tyndall de cuatro litros de ACNC dispersados ​​en solución salina normal y se insertó una botella de agua desionizada (segundo desde la derecha). Imagen d crio-TEM y e HAADF-STEM de ACNC dispersa en solución salina normal. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos individuales. El recuadro en (e) muestra DESA de ACNC. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente. f EXAFS ponderado con k2 y g transformada de Fourier ponderada con k2 del EXAFS para los estándares ACNC y ACC. Las líneas negras punteadas son las que mejor se adaptan. h Patrones SAXS de ACNC dispersos en solución salina normal. La línea sólida roja se ajusta a partículas esféricas. i Distribución de distancia recibida por SAXS de ACNC disperso en solución salina normal. j TGA de polvo de ACNC bajo una atmósfera de N2 con una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1. k Espectros TG-FTIR de polvo ACNC bajo una atmósfera de N2 con una velocidad de calentamiento de 10 °C min-1.

El ACNC no mostró ningún pico cristalino en el patrón de difracción de rayos X en polvo (DRX), incluso después de dispersarse en una solución acuosa durante 6 meses (Figura complementaria 3). La espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) de ACNC exhibió los picos característicos, correspondientes al oxígeno (O 1s), carbono (C 1s), gadolinio (Gd 4d) y calcio (Ca 2p), respectivamente. De acuerdo con la observación anterior de ACC7, los picos con energías de enlace de 350,8 y 347,3 eV se atribuyeron a los estados Ca 2p1/2 y Ca 2p3/2, respectivamente. En el espectro de nivel central de Gd 4d, se observaron dos picos a 142,6 eV y 150,6 eV, que correspondían a los estados de Gd 4d5/2 y Gd 4d3/2, respectivamente (Figura complementaria 4). El ACNC se estudió más a fondo mediante espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) y análisis de estructura fina de absorción de rayos X extendidos (EXAFS), y se reveló que el entorno de Ca-O de corto alcance dentro del ACNC se relaciona estrechamente con los del estándar ACC y ACC informados previamente 10,11,23 (Fig. 1f, g, Tablas complementarias 1, 2). La distribución de tamaño de ACNC recibida del análisis de ajuste SAXS mostró un radio promedio de 1,3 nm (Fig. 1h, i).

Los resultados del análisis termogravimétrico (TGA) y del calorímetro diferencial de barrido (DSC) para ACNC mostraron una pérdida de más del 20% en peso al calentar a 300 °C debido a la deshidratación del ACC, lo que indica un alto contenido de agua del ACNC. Además, la pirólisis del PAA se produjo entre 300 y 500 °C, y el carbonato se descompuso por encima de 550 °C (Fig. 1j y Fig. complementaria 5). Según el resultado de TGA, la composición de ACNC incluía ~20% de contenido de agua, 40% de PAA y 40% de carbonato amorfo. La absorbancia observada en FTIR acoplado a TGA (TG-FTIR) en ACNC a 2358 y 2322 cm-1 por encima de 550 °C correspondió a la vibración de estiramiento asimétrico del CO2 debido a la descomposición del carbonato (Fig. 1k). Como se muestra en la figura complementaria 6, la banda dividida en 1415 y 1454 cm-1 en la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) se puede asignar a la vibración de estiramiento asimétrica de los iones carbonato en entornos ACC típicos20. La espectroscopía Raman confirmó además un pico amplio centrado en 1086 cm-1 atribuido al tramo simétrico interno de CO32 (Figura complementaria 7).

Para investigar la contribución de cada componente al contenido altamente hidratado y al entorno similar al ACC, se sintetizaron una serie de muestras de control con composición variable como se enumera en la Tabla complementaria 3, incluido un compuesto de ACC ocluido con Gd (ACC-Gd). ACC estabilizado con PAA (ACC-PAA), carbonato de gadolinio amorfo (AGC), AGC estabilizado con PAA (AGC-PAA) y dos quelatos libres de carbonato (PAA-Ca y PAA-Ca/Gd). Se realizaron patrones XRD y espectros Raman para identificar la fase amorfa (Figuras complementarias 8a, b) 12. Los resultados de la estructura fina de absorción de rayos X extendida (EXAFS) confirmaron aún más la presencia de ambientes similares a ACC (Fig. 2a, b).

un EXAFS ponderado con k2 y una transformada de Fourier ponderada con k2 del EXAFS para ACNC, estándar ACC, ACC-PAA, ACC-Gd, PAA-Ca y PAA-Ca/Gd. Las líneas negras punteadas son la mejor opción. c Curva termogravimétrica de polvo liofilizado de ACC y ACC-Gd aislado con agua desionizada y luego expuesto al aire seco durante más de 6 meses. La pérdida de peso antes de los 300 °C podría atribuirse a la pérdida de agua. d El contenido de agua de ACC, ACC-PAA, ACC-Gd, AGC, AGC-PAA y ACNC según el análisis termogravimétrico (TG) y las mediciones de titulación volumétrica de Karl Fischer (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE. e Relación molar de moléculas de agua por mol de CaCO3 en ACC, ACC-PAA, ACC-Gd y ACNC en comparación con los rangos de valores informados de ACC sin aditivos (región rosa) y ACC estabilizado con PAA (región naranja) (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE. f Relación molar de moléculas de agua por mol de Gd en AGC, AGC-PAA, ACC-Gd y ACNC (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE.

En ausencia de PAA, ACC-Gd mostró una morfología típica para nanopartículas de ACC agregadas con una distribución uniforme de Gd y Ca (Figura complementaria 9). El resultado de la resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C de ACC-Gd mostró una vibración característica a 168 ppm, lo que indicó la fase precursora de ACC en ACC-Gd (Figura complementaria 10). El espectro FT-IR mostró una consistencia en comparación con la fase de carbonato de calcio amorfo, y la vibración v2 desplazada a un valor más bajo indicó la formación de una fase de carbonato de gadolinio amorfo (AGC) (Figura complementaria 11)24. El pico de oxígeno (O 1s) del resultado XPS del ACG fue bastante similar a la curva del ACC (Figura complementaria 12)7. El espectro XPS de AGC-PAA mostró un perfil similar al de ACNC (Figura complementaria 13).

Se investigaron las transformaciones de ACC-Gd en diferentes medios (etanol, agua) para explorar más a fondo cómo el Gd afectó la estabilidad de ACC. Los resultados de XRD de las muestras se recolectaron en diferentes momentos (Figura complementaria 14). Después de 6 meses, la calcita, la aragonita y la vaterita estaban contenidas en ACNC dispersadas en etanol. En marcado contraste, ACC-Gd se mantuvo estable en etanol durante 6 meses. El ACC sin aditivos recién preparado cristalizó rápidamente después de la dispersión en agua, mientras que el ACC-Gd pudo mantener la fase amorfa durante decenas de minutos. En general, el Gd debería desempeñar un papel razonable en el retardo de la cristalización de ACC. Lo más atractivo es que todavía había un mayor contenido de agua en ACC-Gd en comparación con el ACC puro durante mucho tiempo. Según el resultado de TGA, la pérdida de peso antes de 300 °C de ACC-Gd y ACC en polvo expuestos al aire durante 6 meses fue más del 10% y solo el 0,1%, respectivamente (Fig. 2c). Tenga en cuenta que ACC ha perdido completamente su agua de hidratación en estas condiciones.

Tanto en los resultados de medición de TGA como de la titulación volumétrica de Karl Fischer, la pérdida de peso antes de 300 °C podría asignarse a la pérdida de agua, y ACNC exhibió el mayor contenido de agua de un 20% en peso calculado entre los productos con diferente composición (Fig. 2d). . Según informes anteriores, los contenidos de agua por mol de calcio en ACC sin aditivos y ACC estabilizado con PAA se ubicaron típicamente en el rango de 0,4 a 1,58 y 1,33 a 1,93, respectivamente20,25. Por el contrario, tanto ACC-Gd como ACC-PAA mostraron una mayor proporción de agua a Ca, y la proporción más alta se obtuvo en ACNC (agua/Ca = 7,2) (Fig. 2e), lo que indica una mejora sinérgica de la unión de agua por PAA y Gd en estas nanopartículas amorfas. Más importante aún, para comparar la proporción de agua a Gd como se enumera en la Fig. 2f, el contenido hidratado por mol de gadolinio en presencia de un entorno similar a ACC y PAA en ACNC es más de cuatro veces mayor que el del carbonato de gadolinio ocluido con PAA ( PAA-AGC). En comparación con AGC, la presencia de ACC en el compuesto Gd-ACC también resultó en un aumento del doble del contenido hidratado por ion gadolinio.

Para investigar el origen de la hidratación, se aplicó ultracentrifugación analítica (AUC) para determinar el agua de hidratación de ACNC mediante la relación de fricción y la función de Perrin asumiendo una forma esférica que se ve en las imágenes de microscopía electrónica (Tabla complementaria 4). Las muestras muestran coeficientes de sedimentación del orden de 10-13 s, lo cual es típico de grupos de prenucleación (PNC) que tienen tamaños similares26. Los ACNC tienen un diámetro de 1,5 nm, que es incluso más pequeño que el encontrado por SAXS, aunque todavía están razonablemente de acuerdo. Su masa molar de 2230 g/mol indica que constan de ~20 pares de iones CaCO3, incluidos los iones Gd3+. La cantidad determinada de agua de hidratación unida en solución de 8,8 mol H2O por CaCO3 (y 23,0 mol H2O por Gd3+) es considerablemente mayor que en los ACC comunes (Fig. 2e, f y Tabla complementaria 5). En particular, el contenido de agua de ACNC determinado por AUC concuerda razonablemente con los resultados de TGA, considerando que la hidratación se determinó en estados húmedos y secos, respectivamente6.

Además de la contribución del dopante del ion gadolinio al contenido de ACC altamente hidratado, se logró un comportamiento paramagnético típico en los nanoclusters de carbonato amorfo como se muestra en la curva M – H (Fig. 3a). Tanto la alta hidratación como el confinamiento de los iones de gadolinio y el ACNC paramagnético condujeron a aumentar el rendimiento del contraste de la resonancia magnética. Los tiempos de relajación T1 de ACNC dispersos en solución salina normal en concentraciones variables se midieron utilizando un escáner de RM de 3,0 Tesla. Como se muestra en el mapa T1 (Fig. 3b), la relaxividad longitudinal (r1) de ACNC alcanzó 37,21 mM-1 · s-1 (Fig. 3c), que fue diez veces mayor que la del Gd-DTPA utilizado comercialmente (3,19 mM-1 · s-1). Además de la contribución de las macromoléculas y nanopartículas, el ACNC poseía una relaxividad longitudinal cuatro veces mayor en comparación con el carbonato de gadolinio amorfo modificado con PAA (AGC-PAA) (7,91 mM−1·s−1), lo que se atribuyó al alto contenido de hidratación del ACC. -ambientes similares. Este alto contenido de agua puede atribuirse principalmente a la mayor capacidad de hidratación del Gd3+ trivalente en comparación con los iones Ca2+ divalentes19, que mejoraron razonablemente las relajaciones de las esferas interior y exterior del entorno similar al ACC que ocluyeba el ACNC14.

una curva M – H de ACNC a temperatura ambiente. b, c Mapa T1 y curva de concentración 1/T1 versus Gd de ACNC (R2 = 0,9999), AGC-PAA (R2 = 0,9987) y Gd-DTPA (R2 = 0,9966) bajo 3,0 T. d Relación molar de moléculas de agua por mol de la relaxividad de Gd y r1 en ACNC, ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA) y ACNC(n/10-PAA) (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE. e 1/T1 versus curva de concentración de Gd de ACNC (R2 = 0,9999), ACNC(2n-PAA) (R2 = 0,9999), ACNC(n/2-PAA) (R2 = 0,9999) y ACNC(n/10-PAA) (R2 = 0,9845) bajo 3,0 T. f 1/T1 versus curva de concentración de Gd de ACNC(Gd/Ca=1:10) (R2 = 0,9993) y ACNC(Gd/Ca=1:2) (R2 = 0,9996) bajo 3,0 T. g 1/T1 versus curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (n = 3 muestras independientes). h 1/T1 versus curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (R2 = 0,9993) y 0,5 T (R2 = 0,9999). i 1/T2 versus curva de concentración de Gd de ACNC bajo 3,0 T (R2 = 0,9991) y 0,5 T (R2 = 0,9999). j Evolución de los valores relativos de R1 desde el tiempo cero hasta cada tiempo (R1(t)/R1(0)) para ACNC, Gd-DTPA y PAA-Ca/Gd (n = 3 experimentos independientes). Los datos muestran medias ± DE.

Aquí, evaluamos más a fondo el efecto del contenido de PAA sobre el contenido de agua y la relaxividad. Denotamos la entrada de PAA para el producto ACNC como 'n'. Usando los mismos métodos de síntesis, varios productos con entradas PAA de '2n', 'n/2', 'n/10' (etiquetados como ACNC(2n-PAA), ACNC(n/2-PAA), ACNC(n/10 -PAA)) se obtuvieron en las mismas condiciones experimentales. Encontramos un aumento significativo en el contenido de agua de todo el sistema del producto con la adición de PAA (Figura complementaria 15). Sin embargo, también se detectó un efecto de "montaña rusa" cuando la proporción molar de moléculas de agua por mol de Gd alcanzó su máximo con un tamaño de entrada de "n", pero disminuyó con un tamaño de entrada aumentado como "2n" (Fig. 3d). Además, medimos las relaxividades de estas muestras. Curiosamente, su rendimiento fue muy consistente con el del contenido de agua por Gd en la forma en que la relaxividad de ACNC alcanzó el máximo bajo la condición de 'n', pero se redujo cuando la cantidad de PAA fue '2n' y 'n/2'. . Específicamente, la relaxividad disminuyó significativamente cuando la cantidad de PAA era solo '10/n' (Fig. 3d, e). A la luz de los resultados, quedó claro que la relación molar de moléculas de agua por mol de Gd actuaba fuertemente sobre el rendimiento de los productos. Estas comparaciones sugirieron que la relaxividad estaba cambiando junto con el contenido de agua por Gd, ya que comparten una vía de cambio similar.

Además, diseñamos y fabricamos dos nanoclusters de carbonato amorfo más con diferentes proporciones de Gd agregado para fines de comparación. En la síntesis de ACNC, mol[GdCl3]:mol[CaCl2] equivale a 1:5. También preparamos dos muestras con una relación de alimentación inicial de Gd/Ca de 1:10 y 1:2 (indicadas como ACNC (Gd/Ca = 1:10) y ACNC (Gd/Ca = 1:2), respectivamente). ACNC (Gd/Ca = 1:10) y ACNC (Gd/Ca = 1:2) eran fases amorfas y no se pudieron encontrar picos de cristalización en los patrones de XRD de los dos productos dispersos en soluciones acuosas durante 3 meses (Figura complementaria . dieciséis). ACNC (Gd/Ca=1:10) mantuvo un buen rendimiento en RM con una alta relaxividad de 34,25 mM-1·s-1 cuando la proporción de dopaje con Gd era baja. Sin embargo, cuando se elevó el nivel de incorporación de Gd, los valores de relaxividad longitudinal (r1) de ACNC (Gd/Ca = 1:2) disminuyeron notablemente a 17,21 mM −1·s−1 (Fig. 3f). Una explicación podría ser que la cantidad excesiva de Gd podría perturbar potencialmente el ambiente altamente hidratado similar al ACC, lo que a su vez afectó la generación de ACC con alto contenido de agua. En resumen, la cantidad de dopaje de Gd afectó significativamente la relajación del ACNC paramagnético; se descubrió que el ACNC era el mejor producto en términos de rendimiento de contraste.

Después de tres pruebas, se calculó que el valor r1 de ACNC era ~37,93 ± 0,63 mM-1 · s-1 (Fig. 3g). Además, los valores r1 y r2 de ACNC se midieron bajo diferentes campos magnéticos (3,0 T y 0,5 T), y se calculó su relación r2/r1 correspondiente (Fig. 3h, i). El valor r1 de ACNC medido en 3,0 T fue tan alto como 38,19 mM-1 · s-1, y el valor r2 correspondiente y la relación r2/r1 fueron 72,49 mM-1 · s-1 y 1,90, respectivamente. Utilizando un sistema de escáner de RM de campo bajo (0,5 T), los valores r1 y r2 correspondientes de ACNC fueron 66,37 mM-1 · s-1 y 78,04 mM-1 · s-1, respectivamente, y la relación r2/r1 fue 1,18. Según los resultados de las mediciones del AUC, la masa molar del ACNC con un diámetro de 1,5 nm fue de 2230 g/mol. La densidad de relaxividad de ACNC se puede calcular eventualmente con la ayuda del volumen y el peso molecular (21,46 mM-1 · s-1/nm3, 17,01 mM-1 · s-1/kDa, respectivamente).

Es esencial una alta estabilidad para los agentes de contraste a base de gadolinio, ya que la transmetalación conducirá a la liberación de iones de gadolinio disociados con toxicidad reportada, como fibrosis sistémica nefrogénica14,27. Laurent y Muller informaron sobre la escasa inercia cinética frente a la transmetalación de los agentes de contraste lineales a base de gadolinio, como el Gd-DTPA28 de uso comercial. Como se muestra en la Fig. 3j, el quelato PAA-Ca/Gd mostró una inercia aún peor que el Gd-DTPA después de la exposición a Zn2+ en PBS durante 48 h. Por el contrario, se ha demostrado que ACNC mejoró la estabilidad contra la transmetalación, debido al confinamiento de gadolinio en entornos similares a ACC. Además, abordamos un ensayo de competencia de ligandos en una solución acuosa homogénea que contiene DTPA y ACNC. No hubo evidencia observable que mostrara que la relaxividad de ACNC estuviera significativamente alterada, lo que confirmó que ACNC no se vio afectado por la competencia entre el complejo de Gd (III) y el exceso de ligando libre de DTPA (Figura complementaria 17).

Los espectros de absorción de Arsenazo III se utilizan generalmente para detectar la fuga de iones de gadolinio de nanocompuestos a base de Gd y quelatos de gadolinio29,30. Cuando la solución acuosa de Arsenazo III se mezcló con Gd3+, la solución rosa se volvió azul debido a la formación del complejo arsenazo-Gd3+ (Fig. 4a). Como se muestra en la Fig. 4b, el ion de gadolinio libre a una concentración baja de 1 µg/ml fue detectable mediante espectros de absorción mediados por Arsenazo III. Sin embargo, en la dispersión salina normal de ACNC, no se detectó fuga de iones de gadolinio libres en diálisis de 1 semana utilizando este análisis colorimétrico, que se confirmó además mediante ICP-MS (Fig. 4c). En marcado contraste con ACNC, el quelato PAA-Ca/Gd mostró una fuga obvia en comparación con ACNC, lo que confirma aún más el confinamiento de los iones de gadolinio por el carbonato.

a Fotos de las mezclas de solución acuosa de Arsenazo III con soluciones dializadas de ACNC, solución salina normal (NS, sirvió como control negativo) y solución acuosa de cloruro de gadolinio en concentraciones variables (1, 10 y 100 µg Gd/mL) (sirvió como controles positivos), respectivamente. b Los espectros de absorción de las mezclas de dializado y Arsenazo III y los dializados se recogieron en diferentes puntos de tiempo en 7 días para monitorear la fuga de gadolinio del ACNC. No se controló ninguna fuga detectable de ion gadolinio en comparación con los controles negativo (NS) y positivo (solución acuosa de cloruro de gadolinio). c Análisis cuantitativo y comparación de la fuga de ion gadolinio libre de ACNC y PAA-Ca/Gd en NS mediante ICP-AES. El quelato PAA-Ca/Gd mostró poca inercia en NS, y aproximadamente 9% de gadolinio se filtró del quelato después de 7 días. Por el contrario, se detectaron pocos iones de gadolinio libres en los dializados de ACNC (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE. d, e Espectros de absorción de la mezcla de Arsenazo III con soluciones dializadas recolectadas en diferentes puntos de tiempo de d suero humano con ACNC disperso y e suero humano con ACNC disperso y fosfato adicional suplementado. f Evaluación de la compatibilidad sanguínea de ACNC con diferentes concentraciones de gadolinio (n = 3 muestras independientes). Los datos muestran medias ± DE.

Es bien sabido que el pH juega un papel clave en la homeostasis celular y tisular. Además, los diferentes compartimentos celulares presentan variedad de condiciones ácido-base. Utilizamos tampones PBS con un pH de 6,0 a 6,8 para imitar la condición débilmente ácida de diferentes ubicaciones intracelulares. Aunque se puede observar la fuga de iones Ca, la fuga de iones Gd apenas se detectó en 7 días (Figura complementaria 18). Suponemos que el Gd (III) dentro de ACNC tenderá a formar GdPO4 con fosfato en el tampón PBS debido al menor producto de solubilidad termodinámica (Ksp) del fosfato que el del carbonato31. La precipitación de iones Gd3+ libres se suprimió en condiciones casi neutras (pH = 6), lo que evitó la fuga de iones Gd, lo que indica la buena bioseguridad del ACNC en condiciones de ácido débil. En condiciones de un pH ambiental más ácido (pH 4,5–5,5) simulado por tampones de acetato, la liberación de iones de Gd aumenta ligeramente con la disminución del pH (Figura complementaria 18). En comparación con los resultados en un entorno de PBS, la mejora en la fuga de iones de Gd se atribuyó a la pérdida de protección proporcionada por el fosfato. Por lo tanto, especulamos que era difícil filtrar el Gd (III) del ACNC y que existía como iones en un entorno fisiológico.

Además, ACNC se dispersó en suero humano a 1 mmol (Gd)/L. Mientras tanto, para simular las concentraciones elevadas de fosfato en suero en pacientes con enfermedad renal terminal33, se dispersó la misma concentración de ACNC en suero humano complementada con una concentración adicional de fosfato de 10 mmol/L durante 15 días, seguido de diálisis en diferentes momentos. . No se detectó fuga de iones de gadolinio libres en los dializados utilizando ICP-MS y análisis colorimétrico (Fig. 4d, e y Fig. complementaria 19), lo que indica el bajo riesgo de disociación para ACNC en el período de retención in vivo.

Para determinar si el ACNC causa hemólisis, se incubaron ACNC en diferentes concentraciones con suero sanguíneo humano a 37 °C para una prueba de hemólisis. Según el estándar, los ACNC no tienen hemocilólisis incluso a una concentración alta de 0,5 mg (Gd)/ml, lo que sugiere una buena compatibilidad sanguínea (Fig. 4f). El ensayo MTT se utilizó como evaluación de la citotoxicidad mediante el cocultivo de células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2) o líneas de queratinocitos inmortales humanos (HaCaT) con ACNC durante 24 h y 48 h. Se indujo poca reducción de la viabilidad en las células después de la exposición a ACNC, incluso a una concentración alta de 0,5 mg (Gd)/ml (Figura complementaria 20). Además, se validaron buenas citocompatibilidades tanto de ACNC (Gd/Ca = 1:10) como de ACNC (Gd/Ca = 1:2) (Figura complementaria 21). Alentados por los resultados obtenidos hasta el momento, se llevaron a cabo una serie de estudios de compatibilidad subcelular utilizando células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2). Las mitocondrias sanas de las células HK-2 se demostraron mediante un estudio de potenciales de membrana mitocondrial (MMP) (Figura complementaria 22). El ensayo de tinción de HK-2 con dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) mediado por TdT inmunofluorescente mostró que ACNC no tenía daño acumulado en el ADN nuclear de las células (Figura complementaria 23). Se realizó un ensayo de EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina) y se confirmó que ACNC no tenía efectos sobre la proliferación celular (Figura complementaria 24).

Mientras tanto, se recogieron secciones histológicas de órganos principales 2 semanas después de la inyección intravenosa en ratones a una dosis de 5 mg de Gd/kg, y no se identificó evidencia de cambios patológicos en las imágenes teñidas con H&E (Figura complementaria 25). También se llevó a cabo la tinción con H&E de riñón de conejo y no se observó toxicidad renal aguda (Figura complementaria 26). Tres días y 3 semanas después de la inyección intravenosa de ACNC en ratones, todos los valores de los parámetros hematológicos y bioquímicos estuvieron de acuerdo con el rango estándar y nuestros grupos de control (Figura complementaria 27). Para realizar pruebas adicionales en el perro beagle de gran tamaño con una dosis alta (9 mg de Gd/kg de peso corporal), no hubo diferencias obvias en los parámetros hematológicos y bioquímicos entre los grupos de control y experimentales después de la inyección intravenosa (Figura complementaria 28), lo que sugiere que los cambios fisiológicos Las funciones no se vieron afectadas por ACNC.

La mejora del rendimiento de ACNC en la resonancia magnética ponderada en T1 se confirmó además mediante angiografía por resonancia magnética en ratas, conejos y perros beagle. Después de la inyección intravenosa en bolo de ACNC en una dosis baja (3 mg/kg de peso corporal), se pueden identificar claramente la vena cava yugular, carótida, aorta y caudal (Fig. 5a-c), y la dosis es <1/5 de el valor típicamente empleado en la clínica. Las imágenes de angiografía de cuerpo entero de ratas, conejos y la parte superior del cuerpo de un perro beagle mostraron un mejor contraste angiográfico y más detalles en comparación con las del grupo de control con Gd-DTPA. Mientras tanto, el análisis semicuantitativo mostró claramente que las intensidades de señal en los grupos ACNC tienen una mejora notable en comparación con las de los grupos Gd-DTPA (Figuras complementarias 29, 30). Como se muestra en la Fig. 5d, la mejora del contraste de ACNC in vivo se reflejó cuantitativamente en el valor medio de la relación señal-ruido (SNR) en conejos y perros beagle, respectivamente.

a, b Imágenes de angiografía por resonancia magnética (ARM) con contraste de todo el cuerpo en una rata y b en un conejo inmediatamente después de la inyección en bolo de (i) Gd-DTPA y (ii) ACNC. c Imágenes de ARM de la parte superior del cuerpo de un perro beagle inmediatamente (IM) y 20 s después de la inyección en bolo de (i) Gd-DTPA y (ii) ACNC, respectivamente. (C) y (S) representan el plano coronal y el plano sagital respectivamente. d Medición cuantitativa de la SNR de las ROI en (i) arteria del tronco braquiocefálico, (ii) arteria subclavia izquierda, (iii) arteria carótida común izquierda, (iv) rama derecha de la arteria olfatoria del perro beagle y en (v) aorta descendente , (vi) arco aórtico, (vii) aorta ascendente de conejo, respectivamente. El momento para la medición cuantitativa de la SNR de las ROI fue en el período "IM" (n = 3 experimentos independientes). Los datos muestran medias ± DE. P se calculó utilizando la prueba t de Student de dos colas (**P <0,01, ***P <0,001).

Recientemente, la traducción clínica de biomateriales nanométricos atrajo gran atención, prometiendo el desarrollo de herramientas nanomédicas novedosas y específicas para el diagnóstico y la terapia16,35,36,37,38. La mayoría de los nanomateriales administrados fueron secuestrados por el hígado y el bazo, que se convierten así en las principales barreras biológicas para la traducción de nanomedicinas39. Para evitar el riesgo potencial in vivo, la eliminación renal es la ruta de excreción deseable y preferida de los agentes médicos para un catabolismo y una exposición corporal mínimos. Sin embargo, en comparación con los agentes de contraste de moléculas pequeñas, los agentes de contraste de RM de tamaño nanométrico, especialmente las inyecciones de óxido de hierro de tamaño nanométrico aprobadas por la FDA, sufren de su excreción renal deficiente como resultado de su gran distribución de tamaño (>20 nm)40. El hígado es el objetivo principal o secundario de transmisión de nanopartículas con acceso al sistema circulatorio, lo que resulta en una acumulación inevitable de nanopartículas en el hígado. Las nanopartículas detenidas en el hígado podrían eliminarse del hígado mediante aclaramiento hepatobiliar41. Además de la eliminación convencional del hígado (Figura complementaria 31), se observó la rápida eliminación renal de ACNC de los vasos sanguíneos en las imágenes de ARM después de la inyección intravenosa (Figura complementaria 32). Además, la vejiga del perro beagle también se iluminó en 20 minutos en la imagen T1w (Figura complementaria 33). Además, como se muestra en la curva de concentración sanguínea-tiempo en ratones y perros beagle medida por ICP-AES, podría eliminarse eficazmente de los vasos sanguíneos en 6 h y rara vez queda contenido residual de gadolinio después de 24 h (Fig. 6a). , by Tabla complementaria 6). En la orina de rata recolectada después de la inyección intravenosa de ACNC, ICP-AES detectó el contenido de gadolinio y demostró una eficiencia de eliminación renal de ~13% ID a las 24 h (Figura complementaria 34), que es comparable a la del oro. nanoclusters con diámetros similares42. Se pudieron observar abundantes agregados de grupos amorfos de SAED en imágenes TEM de orina dializada (Fig. 6c), y el mapeo de EDS reveló una distribución coincidente de elementos de gadolinio, calcio, carbono y óxido en estos agregados correspondientes a ACNC (Fig. 6d, e) . La estabilidad fisicoquímica y fisiológica en sinergia con una dosis de inyección baja y una eliminación parcial a través del riñón condujeron a la biocompatibilidad in vivo y a la posible capacidad de traducción de estos grupos de carbonato amorfo a base de gadolinio.

a, b La distribución dependiente del tiempo de ACNC en plasma de ratones a y perros beagle b en 24 h (n = 5 animales biológicamente independientes). Los datos muestran medias ± DE. c TEM, d resultados de EDS y e imagen HAADF-STEM y mapeo EDS de ACNC observados en orina de rata recolectada 12 h después de la inyección. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos individuales. El recuadro de c es el patrón relativo de SAED. Los experimentos se repitieron tres veces de forma independiente.

Se han diseñado y aprobado en todo el mundo varios agentes de contraste a base de gadolinio para la RM T114. Como resultado de una alta densidad de electrones libres en la banda de valencia y una funcionalización versátil para interactuar con biomoléculas in vivo, se prevé que los nanomateriales inorgánicos que sirven como agentes de contraste en diversas modalidades de imágenes logren la traducción clínica de la nanomedicina15,43. Por lo tanto, los científicos estudiaron incansablemente incluyendo diversos métodos de fabricación y aclarando la farmacocinética para investigar la traducibilidad de las nanopartículas inorgánicas basadas en Gd16. Teniendo en cuenta el peligro que supone la liberación de iones de Gd libres, un objetivo específico era reducir la dosis de nanopartículas inyectadas mediante un rendimiento mejorado.

El nivel de hidratación juega un papel importante en la determinación del rendimiento de contraste de un agente de contraste para RM14. Desafortunadamente, el contenido de hidratación de los nanocristales a base de Gd está limitado por los procesos tradicionales de síntesis a alta temperatura15. Vale la pena mencionar que el alto contenido de humedad, incluida el agua interior y el agua estructural ubicada profundamente, es la característica más distintiva de ACC7,8,9,10,11. Sin embargo, la posible aplicación del ACC hidratado inestable se ignora en gran medida. Curiosamente, el radio iónico del ion gadolinio es muy cercano al del ion calcio, lo que implica una posible interacción entre los iones de gadolinio y los iones de calcio que podemos aprovechar.

En resumen, nuestro estudio confirma los efectos mutuos entre el ion lantánido paramagnético gadolinio y el carbonato de calcio amorfo, lo que es beneficioso para maximizar el contenido de agua en los nanoclusters compuestos amorfos obtenidos. El material se sintetiza mediante un sencillo proceso en un solo recipiente a temperatura ambiente, lo que permite una producción rentable y a gran escala. Es importante destacar que este alto contenido de agua contribuye a la mejora del contraste transparente en la resonancia magnética de los nanoclusters a base de gadolinio. En combinación con su baja toxicidad, eliminación renal parcial y fácil potencial para la producción en masa, nuestro trabajo permite una mayor identificación del potencial biomédico de los compuestos de ACC, y anticipamos que podría conducir a una próxima generación de agentes de diagnóstico más eficientes basados ​​en nanoclusters amorfos en el futuro.

El cloruro de calcio anhidro, el carbonato de sodio anhidro y el alcohol etílico se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd (Shanghai). El cloruro de gadolinio hexahidrato (GdCl3 · 6H2O, 99,95%) se adquirió de Yutai QingDa Fine Chemical Co., Ltd. (Shandong, China). El poli(ácido acrílico) (PAA, Mw ≈ 1800) se adquirió de Aldrich. Todos los reactivos se utilizaron tal como se recibieron sin purificación adicional. El Gd-DTPA utilizado comercialmente fue producido por Guangdong Consun Pharmaceutical Group, China (especificación: 20 ml).

En un procedimiento típico para sintetizar carbonato de calcio amorfo (ACC) sin aditivos, se vertieron 10 ml de una solución acuosa de Na2CO3 (0,1 mol·L-1, 10 ml) en soluciones acuosas de cloruro de calcio (0,1 mol·L-1, 10 ml). bajo agitación magnética vigorosa durante 15 s. La suspensión acuosa después de agregar 20 ml de etanol se centrifugó a 850 x g durante 2 minutos inmediatamente, luego los precipitados se lavaron con etanol y se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 x g dos veces.

En un procedimiento típico para sintetizar ACNC, se disolvieron cloruro de calcio anhidro (CaCl2, 0,1 mol·L-1), cloruro de gadolinio hexahidrato (GdCl3, 0,02 mol·L-1) y PAA (0,45 g) en 10 ml de DIW con solución magnética. emocionante. Se vertió carbonato de sodio anhidro (Na2CO3, 0,1 mol·L-1, 10 ml) en la solución anterior con agitación magnética vigorosa durante 1 min. Se añadieron 20 ml de etanol para terminar la reacción. La mezcla se centrifugó inmediatamente durante 2 minutos a 850 x g, y los precipitados se resuspendieron mediante DIW y se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 x g dos veces. Para la síntesis a escala de un litro, el volumen de reacción se aumentó 50 veces y se llevó a cabo bajo agitación mecánica intensa.

Para la síntesis de ACC estabilizado por PAA (ACC-PAA), se usaron 0,45 g de PAA en el proceso de síntesis sin la adición de sal de gadolinio y el producto se lavó con etanol. Para la preparación de ACC-Gd, el PAA estuvo ausente en el proceso de síntesis y se mezclaron CaCl2 anhidro (0,1 mol·L-1) y GdCl3 (0,02 mol·L-1) en 10 ml de DIW. Luego el ACC-Gd obtenido se lavó con etanol.

En un procedimiento típico para sintetizar carbonato de gadolinio amorfo (AGC) y AGC-PAA, se vertió Na2CO3 (0,1 mol·L-1, 10 ml) en 10 ml de solución acuosa de GdCl3 (0,067 mol·L-1, mol[GdCl3): mol[Na2CO3] = 2:3) bajo agitación magnética vigorosa durante 15 s, luego se vertieron 20 ml de etanol en la suspensión acuosa. Después de centrifugar a 850 x g durante 2 minutos inmediatamente, los precipitados se lavaron con etanol y se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 x g dos veces. Además, en presencia de 0,45 g de PAA en la solución acuosa de GdCl3, se preparó AGC-PAA mediante el mismo procedimiento.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se realizó en H7700 (Hitachi, Japón) con un voltaje de aceleración de 100 KV. La microscopía electrónica de criotransmisión (crio-TEM) se realizó en un microscopía crioelectrónica de transmisión Tecnai F20. El TEM de escaneo de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF-STEM), el espectrómetro de dispersión de energía (EDS) y el mapeo EDS se realizaron en un microscopio electrónico de transmisión de alta resolución de emisión de campo (FEI, Talos F200X). Los patrones de difracción de rayos X en polvo (DRX) se realizaron en un difractómetro de rayos X de ánodo giratorio (SmartLabTM 9 kW). La espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó en un espectrómetro de fotoelectrones (ESCALAB, 250Xi, Thermo Fisher, EE. UU.). La resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C se realizó en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de estado sólido WB de 400 MHz (Bruker AVANCE III 400 WB). Los espectros FT-IR se registraron con un espectrómetro FT-IR Thermo Nicolet 8700 a temperatura ambiente. Los espectros Raman se registraron utilizando un espectrómetro Evolution Raman de alta resolución (HR) Horiba LabRAM. La fuente de luz del microscopio se transfirió a un láser de diodo (780 nm). Los espectros se escanearon durante 3 × 100 s44,45. Se registraron análisis termogravimétricos (TGA), calorímetro diferencial de barrido (DSC) y análisis de termogravimetría junto con espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (TG-FTIR) a una velocidad de calentamiento de 10 K min-1 bajo un flujo de nitrógeno en un analizador térmico TGA (NETZSCH STA 449F3). La investigación magnética se llevó a cabo en un magnetómetro de dispositivo de interfaz cuántica superconductora (SQUID) (Quantum Design SQUID-VSM). ICP-AES se realizaron en un instrumento Optima 7300 DV. Los espectros UV-vis se midieron en un espectrofotómetro Shimadzu UV-2600 a temperatura ambiente.

El análisis de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) se realizó en un SAXSpoint 2.0 (Anton Paar). La función de distribución de tamaño determinada por SAXS se evaluó utilizando el software GIFT (transformación indirecta generalizada de Fourier) con la condición previa de esferas homogéneas ponderadas por número. Se calcula utilizando las siguientes fórmulas46:

Las mediciones de espectroscopía de absorción de rayos X (XAS) en el borde K del calcio (4,0381 keV) se llevaron a cabo en el sincrotrón Elettra de Italia, que funciona con una energía de 2 GeV y una corriente de 300 mA. Las muestras se trituraron en un mortero de ágata, se diluyeron con polvo de grafeno y se compactaron en finos gránulos. Se preparó un espesor de muestra óptimo de ~ 300 μm y una concentración óptima de calcio después de una dilución óptima con polvo de grafeno para cada muestra, incluidos los estándares ACNC, ACC-Gd y ACC. Se recogieron tres escaneos completos por muestra de la estructura de absorción de rayos X cerca del borde (XANES) y la estructura fina de absorción de rayos X extendida (EXAFS) en modo de transmisión utilizando un detector de cámara de iones FMB-OXFORD, en pasos de 5 eV en el pre -región del borde (de 3738,43 a 4028,53 eV) y 0,2 eV en la región del borde (de 4061,51 a 4061,71 eV), aumentando gradualmente a 2,6 eV en la región posterior al borde (4061,71 a 4589,30 eV) hasta k = 13. Alineación, La calibración de energía y la eliminación de fallos se realizaron utilizando funciones integradas del paquete de software Athena47. La primera capa de coordinación alrededor del calcio (Ca-O) se instaló generando una única vía de dispersión de Ca-O basada en datos cristalográficos de calcita. El análisis de vías de dispersión única se realizó de 1,3 a 2,53 Å en el espacio R en datos ponderados k2 transformados de Fourier de 3 a 9,1 Å. Los errores estándar asociados con el ajuste de datos EXAFS en el rango k utilizado aquí son del 15% para el número de coordinación del primer nivel, 0,03 Å para la distancia radial y 15% para los factores de Debye-Waller.

Los puntos de datos independientes fueron determinados por la regla de Stern que define la limitación fundamental a la cantidad de información que puede determinar XAFS. Según la regla de Stern, el número de parámetros (Npar) utilizados para el ajuste debe ser estrictamente inferior al número de parámetros independientes (Nind) definidos como 2∆k∆R/π + 2, donde ∆k y ∆R son los ajustados. rango en el espacio k y R, respectivamente48,49. Si Nind < Npar, el modelo no puede tomarse como prueba del entorno de coordinación porque el conjunto de datos está subdeterminado por el nivel de complejidad del modelo. En este caso, Nind = 7,5 para ACC estándar, ACC-Gd y muestra ACNC, Nind = 8,16 para ACC-PAA y Npar = 4 como tal que Nind > Npar. El modelo multicomponente que produce el mejor ajuste de los datos experimentales se considera razonable y, por lo tanto, puede considerarse como una representación probable para caracterizar el entorno de coordinación del calcio. La combinación lineal se realizó en XANES y en la región cercana a EXAFS (de 30 Å-1 antes a 80 Å-1 después del salto de borde). Las muestras ACC-Gd, ACNC y PAA-Gd/Ca se compararon con las muestras estándar ACC-PAA y PAA-Ca.

Las mediciones de AUC se realizaron en un Optima XL-A modificado (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) utilizando una óptica de absorbancia y una óptica de interferencia Rayleigh avanzada desarrollada por Nanolytics (https://www.nanolytics-instruments.de/ interferencia_opticas_aida). Para todos los experimentos se utilizaron piezas centrales de titanio de doble sector de 12 mm de longitud de trayectoria con ventanas de zafiro (Nanolytics, Potsdam, Alemania). Para la medición de la muestra de ACNC, la muestra de ACNC original se sedimentó previamente en una centrífuga UNIVERSAL 320 Hettich (Hettich, Tuttlingen, Alemania) durante 20 minutos a 9000 rpm, correspondiente a una fuerza centrífuga de 6000 × g. Se utilizaron 360 µL de solución de ACNC pretratada en el sector de muestra y 360 µL de una solución de PAA-Ca/Gd de prerreacción diluida 1:175 (con NaCl 0,154 M) (mezcla acuosa que incluye PAA, cloruro de calcio y cloruro de gadolinio) en el sector de muestra. sector de referencia. Para la medición de la muestra de PAA como referencia, se disolvieron 10 mg de PAA (1800 Da) en 1 ml de solución de NaCl 0,154 M. Todas las muestras se investigaron a 20 °C y 60.000 rpm, lo que corresponde a una fuerza centrífuga de hasta 290.000 × g.

Los datos de velocidad de sedimentación se evaluaron con Sedfit y UltraScanIII. En Sedfit (Schuck, PP SEDFIT versión 16.1c. http://analyticalultracentrifugation.com/download.htm), se utilizaron los modelos ls-g*(s) y c(s,ff0) continuo. Para el cálculo de las distribuciones de coeficientes de sedimentación g(s) con el modelo de mínimos cuadrados g*(s)50, los datos se ajustaron con una regularización de Tikhonov-Phillips utilizando un nivel de confianza (ratio F) de 0,683 y una resolución de cuadrícula de 100. puntos. Para la determinación de la densidad de partículas sedimentadas51 con el análisis c(s,ff0)52, los datos se equiparon con una regularización de entropía máxima utilizando un nivel de confianza (relación F) de 0,683 y una resolución de 100 puntos de cuadrícula en s y 10–20 cuadrículas. puntos en f/f0. Las distribuciones 2D c(s,ff0) se trazaron utilizando el software MATLAB versión R2017b, 64 bits de MathWorks. Para calcular la densidad de la muestra a partir de distribuciones 2D, se utilizó un script de máscara MATLAB desarrollado por Quy Khac Ong (Instituto de Materiales, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Estación 12, 1015 Lausanne, Suiza. Correo electrónico: quy.ong @epfl.ch). Para la caracterización de la anisotropía, UltraScanIII (Demeler, B. UltraScan versión 4.0, versión 2783. Un paquete de software de análisis de datos completo para experimentos analíticos de ultracentrifugación. Universidad de Lethbridge, Departamento de Química y Bioquímica. http://www.ultrascan3.aucsolutions. com/download.php) se utilizó para realizar el análisis de espectro bidimensional (2DSA)53. Los análisis 2DSA-Monte Carlo (MC) se realizaron con 50 iteraciones en una supercomputadora.

La función que define la forma, la flexibilidad y el grado de solvatación (por agua, iones de sal y cualquier otra molécula de disolvente) de la macromolécula es la función de fricción traslacional de Perrin, P (ver la siguiente ecuación). Este grado de asociación de agua se denomina hidratación del soluto, δ, y se define como la masa en gramos de disolvente asociado por gramo de soluto anhidro54.

donde f/f0 es la relación de fricción (que es la relación adimensional del coeficiente de fricción traslacional f observado con respecto al de una molécula esférica equivalente de la misma masa anhidra y densidad f0), \(\bar{v}\) es la relación parcial volumen específico (cm3/g) del soluto y \({\bar{v}}_{s}\) es el volumen específico hidratado (el volumen ocupado por el soluto y el disolvente asociado por unidad de masa del soluto anhidro) y \({\bar{v}}_{{{{{\rm{H2O}}}}}}}\) = volumen específico de agua dado como:

Si todo el exceso de fricción se debe a la hidratación y el soluto es una esfera, entonces P es 155 y la hidratación se puede calcular como:

Los moles de moléculas de agua por mol de CaCO3 se calcularon así de acuerdo con el resultado de la espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES), el análisis de TG y la medición volumétrica de valoración Karl Fischer. La medición de la titulación se realizó en un valorador de humedad Karl Fischer (V10S, valorador volumétrico KF, Mettler Toledo). El contenido hidratado se asignó como la pérdida de peso a partir del pico endotérmico hasta 300 °C, mientras que el contenido de iones Ca2+ y Gd3+ se determinó mediante ICP-AES. Por tanto, la relación molar entre agua e iones Ca2+ en ACC se puede calcular según informes anteriores20,56,57.

La detección de fugas de ion gadolinio se llevó a cabo utilizando un método descrito anteriormente29,30. Los ACNC se dispersaron en una serie de entornos fisiológicos simulativos que incluían solución salina normal, suero humano y suero humano suplementado con una concentración adicional de fosfato de 10 mmol/l. ACNC se dispersó con una concentración final de 1 mmol (Gd)/L. La diálisis de ACNC se realizó a 37 °C durante 7 días utilizando una bolsa de diálisis (MWCO 1000 Da). La concentración de gadolinio en los dializados recolectados en diferentes momentos se midió tanto mediante el ensayo cromogénico mediado por Arsenazo III como por ICP-AES. En el ensayo cromogénico, los dializados recolectados se mezclaron con Arsenazo III (0,05 mM) disuelto en una solución tampón de ácido cloroacético e hidróxido de sodio (pH 2,8) y se detectó la absorción a 658 nm. Se utilizaron solución salina normal y solución de GdCl3 como controles negativos y positivos, respectivamente.

Las muestras de ACNC, Gd-DTPA y PAA-Ca/Gd se prepararon recientemente. En t = 0, cada muestra (Gd 2,5 mM) y solución acuosa de ZnCl2 (250 mM, 20 μL) se mezclaron en un tampón fosfato de 2 ml. Luego, se introdujo 1 ml de solución mixta en una botella cromatográfica para su medición. Las mediciones se llevaron a cabo a 37 °C en un sistema de análisis e imágenes de RMN NMI20-Analyst de 0,5 T. TR/TE = 100/5,6 ms. Los tiempos de relajación longitudinal se midieron en diferentes momentos28. La tasa de relajación en t = 0 (indicada como R1(0)) se calculó mediante la fórmula R1 = (1/T1). Las tasas de relajación en otros puntos temporales se calcularon y registraron respectivamente como R1(t) correspondiente, con el fin de evaluar la transmetalación de 2 días mediante el seguimiento de la relación de R1(t)/R1(0).

Se añadió 1 ml de solución acuosa de ACNC (Gd 5 mM) a 1 ml de solución de DTPA (5 mM) y se tomó la solución homogénea para medir. En comparación con el Gd-DTPA comercial, la concentración de las soluciones de Gd-DTPA fue idéntica a la de las soluciones de ACNC como Gd 5 mM. Las mediciones y cálculos fueron consistentes con el estudio de transmetalación.

Se introdujo 1 ml de solución acuosa de ACNC (1 mg (Gd)/ml) en bolsas de diálisis (MWCO: 1000 KD). Luego, las bolsas se colocaron en 50 ml de PBS o tampones de acetato con diferente pH y se incubaron con agitación a 50 rpm a 37 °C. Recolectamos todas las soluciones de PBS o acetato circundantes en cada intervalo de tiempo para su análisis y luego las reemplazamos con 50 ml de PBS o tampones de acetato nuevos. Para evitar posibles interferencias que los iones metálicos libres generados por la degradación precipiten con los iones fosfato en el tampón PBS, se añadió 1 ml de ácido cloroazótico recién preparado (HNO3/HCl = 3:1) a la solución de PBS o acetato circundante recolectada. , lo que produce un ambiente fuertemente ácido (pH < 3,0) de la solución mezclada. Finalmente, ICP-AES determinó las concentraciones de iones Gd en las soluciones circundantes.

Se cultivaron células epiteliales tubulares renales humanas (HK-2) y líneas celulares de queratinocitos inmortales humanos (HaCaT) en medio Eagle modificado por Dulbecco. La viabilidad celular se realizó mediante el método MTT estándar. Brevemente, las células se sembraron en placas a una densidad de aproximadamente 1 x 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante 12 h. Luego se añadió medio de cultivo DMEM con ACNC y las células se expusieron a ACNC en diversas concentraciones durante 24 h y 48 h. Luego se agregaron 10 μL de solución de MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pocillo para una incubación adicional de 4 h a 37 °C. Después de retirar el medio, se agregaron 150 μL de DMSO para disolver los cristales de formazán formados en cada pocillo y se midió la densidad óptica de la solución a 570 nm usando un lector de microplacas (BioTek Instruments, EE. UU.). La célula HK-2 se utilizó para el ensayo de potenciales de membrana mitocondrial (MMP), el ensayo de etiquetado dUTP Nick-End mediado por TdT (TUNEL) y el ensayo de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU). Kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial con agregados J (JC-1) (Beyotime, Shanghai, China), kit de ensayo de apoptosis TUNEL de un solo paso (Beyotime, Shanghai, China) y kit de proliferación celular EdU con Alexa Fluor 555 (Beyotime, Shanghai , China) estaban empleados.

La sangre para el experimento fue recolectada profesionalmente de voluntarios por profesionales médicos en el departamento de transfusión de sangre del primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Anhui. Los estudios de sangre se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China y la Universidad Médica de Anhui (número de licencia: 20170267, 20170268).

Se adquirieron ratones BALB/c libres de patógenos específicos (SPF) (machos, 6 semanas), conejos de Nueva Zelanda (machos, 2 kg) y perros Beagle (machos, 6 kg) de la Universidad Médica de Anhui. Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Los estudios de compatibilidad in vivo y los estudios de resonancia magnética in vivo se realizaron según protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Anhui (LLSC20170299, LLSC20170300) y el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China (2021- N(A)-041).

Se inyectaron por vía intravenosa soluciones salinas normales de ACNC en ratones (a través de la vena de la cola) en una dosis de 5 mg Gd/kg de peso corporal y en perros Beagle (a través de la vena de las extremidades posteriores) en una dosis de 9 mg Gd/kg de peso corporal. Para la evaluación del índice sanguíneo y el índice bioquímico, los ratones fueron sacrificados con anestésicos durante 3 días y 3 semanas después de la inyección intravenosa, respectivamente. Se recogió sangre de perros Beagle cada dos semanas a través de la vena de las extremidades posteriores. Las muestras de sangre se recogieron mediante tubos de recogida de sangre con anticoagulante y tubos de gel separador. El examen de índice sanguíneo e índice bioquímico se realizó en Sysmex XE2100 y Vitros 5600, respectivamente.

Se inyectaron por vía intravenosa soluciones salinas normales de ACNC en veinte ratones (machos, 20 g) a 3 mg de Gd/kg de peso corporal (0,5 mg de Gd/ml, 120 µl) mediante inyección manual rápida para un estudio de inyección en bolo simulado. Estos ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos y se extirparon varios órganos de los ratones en cada grupo 1, 7, 15 y 30 días después de la inyección intravenosa, respectivamente. Las muestras de orina se recolectaron 12 h después de la inyección iv de ACNC en ratas a 5 mg de Gd/kg de peso corporal, seguida de diálisis a 25 °C. Después de 24 h, se recogieron los dializados en bolsas de diálisis (MWCO = 1000 Da) para su posterior caracterización.

ACNC y Gd-DTPA dispersos en solución salina normal en concentraciones de gradiente en microtubos de 5 ml se colocaron sobre un soporte sumergido en solución de NiSO4. Las concentraciones de gadolinio se midieron mediante ICP-AES. El mapa MR T1 se adquirió utilizando una secuencia de recuperación de inversión en un escáner de MR de 3,0 Tesla (Trio Tim, Siemens) equipado con una bobina de cabeza. Los parámetros de imagen fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR) = 4000 ms, tiempo de eco (TE) = 14 ms, tiempo de inversión (TI) de 25 a 3500 ms (TI incluyó 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 , 300, 350, 400, 500, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500 ms), campo de visión (FOV) = 220 × 144 mm2. La relaxividad longitudinal (r1) se calculó de la siguiente manera según una ecuación informada anteriormente con un gradiente de concentración de 0,05 a 0,4 mM de ion gadolinio. El inverso del tiempo de relajación (1/T1, s-1) se representó frente a la concentración de gadolinio, y la pendiente del gráfico fue la relaxividad del agente (mM-1 · s-1)58,59. Las mediciones en un sistema de escáner de RM de campo bajo se realizaron utilizando un instrumento LF-NMR de 0,5 T a 32 °C proporcionado por Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation.

Después de una anestesia intravenosa completa, los animales se fijaron sobre diferentes soportes de tamaño adecuado. Luego, se inyectó por vía intravenosa ACNC disperso en solución salina normal o Gd-DTPA diluido en solución salina normal. Se inyectó a la rata desde la vena caudal utilizando una aguja permanente a una dosis de 2,5 mg de Gd/kg. La inyección en bolo en conejos y perros beagle se realizó a una dosis de 3 mg de Gd/kg desde las venas de las extremidades anteriores mediante un inyector mecánico de alta presión (Optistar LE, Mallinckrodt, EE. UU.). Se empleó la secuencia FLASH 3D para recopilar datos angiográficos. Los parámetros detallados de la angiografía por RM de rata fueron los siguientes: Se utilizó una bobina para rodilla. TR = 3,95 ms, TE = 1,9 ms, FOV: 210 × 280 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 24,62 s. El ángulo de giro (FA) fue 20. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Los parámetros detallados de la angiografía por RM de conejo fueron los siguientes: Se utilizó una bobina local para cabeza y cuello. TR = 3,6 ms, TE = 1,65 ms, FOV: 210 × 280 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 23,4 s. El ángulo de giro (FA) fue 18. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Los parámetros detallados de la angiografía por resonancia magnética del perro beagle fueron los siguientes: una bobina local para cabeza y cuello, una bobina para la columna y radiofrecuencia. Se utilizaron bobinas de transmisión del cuerpo. TR = 3,19 ms, TE = 1,28 ms, FOV: 240 × 320 mm2. El tiempo de adquisición (TA) fue de 20,74 s. El ángulo de giro (FA) fue 16. La matriz de adquisición fue 288p * 512. El número de adquisición y el número de promedios fueron ambos 1. Las imágenes fueron procesadas en primer lugar por la estación de trabajo Siemens Syngo MR.

La relación señal-ruido (SNR) se calculó en una sola imagen (κ) en función de dos regiones de interés (ROI) separadas. Uno en el vaso de interés (ROIvessel) se midió colocando una señal en el mismo ROI en el mismo corte tanto en el grupo Gd-DTPA como en ACNC, que se registró como la intensidad de señal media del vaso (Svessel). Uno en el fondo de la imagen (ROIantecedentes) estaba ubicado en un área homogénea libre de artefactos, que se definió como la señal de fondo (Santecedentes)34. La SNR corresponde a la relación entre Svessel y Sbackground y se calculó utilizando la ecuación. (5):

Se seleccionaron tres regiones de interés en la aorta descendente, el arco aórtico y la aorta ascendente en conejos, y se midieron cuatro regiones en la arteria troncal braquiocefálica, la arteria subclavia izquierda, la arteria carótida común izquierda y la rama derecha de la arteria olfatoria en un perro beagle, respectivamente.

Todos los datos se expresaron como media ± DE. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas para el análisis estadístico de la comparación entre dos grupos, y se utilizó ANOVA unidireccional para el análisis estadístico de la comparación entre múltiples grupos. Un valor de P < 0,05 se consideró diferencia estadística (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001). La significación estadística se determinó utilizando la estadística SPSS 17.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos generados en este estudio se proporcionan en el artículo y en la Información complementaria, o están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones 51732011 y U1932213 a SHY; 22122502 y 51972090 a YL; 51702309 a LD; 81801831 a HQW), el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (Subvenciones 2021YFA0715700 y 2018YFE0 202201) a SHY, los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (WK9110000062 a YJX; WK2060190056 a LD), el Programa de Innovación de Sinergia Universitaria de la Provincia de Anhui (Subvención GXXT-2019-028) a SHY, Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Anhui (201903a05020003 ) a SHY, la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Anhui (2008085J06 a YL; 1708085ME114 a YJX), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2015M570540) a LD, la Fundación del Programa Principal/Innovador de Desarrollo del Centro de Ciencias Físicas y Tecnología de Hefei (2016FXZY005 ) a YL Los autores desean agradecer a Mei Sun, Yan-Wei Ding, Cheng-Min Wang, Yu-Song Wang, Guan-Yin Gao, Han-Bao Chong, Yu-Feng Meng, Yang-Yi Liu en la Universidad de Ciencias. y Tecnología de China, Hao Ding en Suzhou Niumag Analytical Instrument Corporation, Yong-Hong Song, Wen-Shu Wu en la Universidad Tecnológica de Hefei, Hai-Shen Qian en la Universidad Médica de Anhui, He Chen, Li Zhang y Hui Wang en The First Affiliated Hospital de la Universidad Médica de Anhui, Kun Liu en la Universidad de Xiamen, Duo An en la Universidad de Cornell y Ye-Ping Li de Anton Paar China por su útil ayuda con este manuscrito, y Luca Olivi, Giuliana Aquilanti y Simone Pollastri en la línea de luz XAFS en el Sincrotrón Elettra. por su ayuda. DG es profesor de la Universidad Leibniz de Hannover. JA se financia en el marco del SFB 1214 (Centro de investigación colaborativa financiado por la Fundación Alemana de Investigación, DFG, proyecto A02). HC agradece al centro de análisis de partículas del SFB 1214 por el equipamiento AUC.

Estos autores contribuyeron igualmente: Liang Dong, Yun-Jun Xu, Cong Sui.

Departamento de Química, Instituto de Química y Materiales Biomiméticos, Laboratorio de Ingeniería de Materiales Biomiméticos de Anhui, División de Nanomateriales y Química, Centro Nacional de Investigación de Ciencias Físicas a Microescala de Hefei, Instituto de Energía, Centro Nacional Integral de Ciencias de Hefei, Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, 230026, China

Liang Dong, Cong Sui, Yang Zhao, Li-Bo Mao, Huai-Ling Gao, Zhao Pan y Shu-Hong Yu

Hospital Oncológico de la Universidad de la Academia de Ciencias de China (Hospital Oncológico de Zhejiang), Instituto de Medicina Básica y Cáncer (IBMC), Academia de Ciencias de China, Hangzhou, Zhejiang, 310022, China

Liang Dong y Zhao Pan

Laboratorio clave de materiales catalíticos avanzados e ingeniería de reacción de la provincia de Anhui, Facultad de Química e Ingeniería Química, Universidad Tecnológica de Hefei, Hefei, 230009, China

Liang Dong, Ya-Dong Wu, Xu Yan, Fei Li y Yang Lu

Departamento de Radiología, Hospital Provincial de Anhui, Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China, Hefei, 230001, China

Yun Jun Xu

Instituto de Química Inorgánica, Leibniz Universität Hannover, Callinstr. 9, 30167, Hannover, Alemania

Denis Gebauer

Química Física, Departamento de Química, Universidad de Konstanz, Universitätsstr. 10, Constanza, D-78457, Alemania

Rose Rosenberg y Helmut Cölfen

Científico - Centro de Análisis de Rayos X, Empa - Laboratorios Federales Suizos de Ciencia y Tecnología de Materiales, Lerchenfeldstrasse 5, 9014, St. Gallen, Suiza

jonathan avaro

Departamento de Transfusión de Sangre, Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, 230022, China

Hui-Qin Wen

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SHY y YL concibieron la idea, diseñaron los experimentos y supervisaron la investigación; LD, CS, YL, YZ, LBM, DG, HC, RR, YDW y FL llevaron a cabo el experimento sintético y el análisis. DG, JA, HC y LD trabajaron en la medición y análisis de EXAFS. LD, YZ, HLG, ZP, HQW, XY y FL procesaron la evaluación de biocompatible. LD, YJX, YDW, YL, HLG, ZP, XY, FL y CS trabajaron en experimentos con animales, LD, YJX, YL, FL y CS investigaron el rendimiento de la resonancia magnética, LD, YJX, CS, DG, YL, HC y SHY escribieron el artículo, todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Yang Lu, Helmut Cölfen o Shu-Hong Yu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Peng Huang y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Dong, L., Xu, YJ., Sui, C. et al. Nanoclusters de carbonato de calcio amorfo paramagnético altamente hidratados como agente de contraste para resonancia magnética. Nat Comuna 13, 5088 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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Recibido: 06 de junio de 2021

Aceptado: 08 de agosto de 2022

Publicado: 29 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32615-3

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